張國文，吳健妹，倪孟婷

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

α-淀粉酶(α-amylase，別稱α-1,4-D-葡聚糖水解酶)能將食用后的淀粉降解成低聚糖和寡糖[1]后，在小腸經α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖，葡萄糖通過體內系統吸收和轉運至血液，引起血糖含量升高[2]，故而α-淀粉酶也是控制餐后可吸收糖產生的關鍵酶之一。因此，有效抑制α-淀粉酶的活性，降低淀粉水解為低聚糖的速率，進而影響后續(xù)可吸收單糖的生成速率，達到控制餐后血糖水平過高的目的，已成為臨床防治糖尿病的主要手段之一[3]。目前，臨床使用的α-淀粉酶抑制劑是有與底物有相似環(huán)狀結構的阿卡波糖[4]，它競爭性地阻礙了底物接觸α-淀粉酶的結合位點，從而發(fā)揮抑制酶活的效果，但阿卡波糖在使用中的安全性仍存在爭議。因此，從天然膳食中尋找安全無毒、藥效高的α-淀粉酶抑制劑對防治糖尿病有重要的臨床意義。

牡荊素(Vitexin)是一種天然膳食黃酮，在山楂、綠豆、金蓮花和無花果樹[5,6]等多種食物和傳統草藥中含量豐富，具有抗氧化、抗糖尿病等生物活性，且無明顯的急性、亞慢性毒性和遺傳毒性[7]。Nurdiana等[6]發(fā)現喂食無花果葉和牡荊素給鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠后，糖尿病癥狀減輕。Yang等[8]報道從毛竹葉中提取的牡荊素可以延緩淀粉的消化。然而，關于牡荊素抑制α-淀粉酶的分子機制知之甚少。因此，本文利用酶促動力學方法測定牡荊素對α-淀粉酶的抑制作用類型和抑制常數，并聯合應用多種光譜學手段和計算機模擬技術研究牡荊素與α-淀粉酶相互作用的結合特性、空間結合構象及其誘導酶分子結構的變化對酶催化底物的影響，進而闡明牡荊素抑制α-淀粉酶的分子機制，以期為牡荊素作為降糖食品功能因子研發(fā)提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電子天平(BSA224S型，Sartorius公司，德國)；紫外-可見(UV-vis)分光光度計(UV-2450型，島津公司，日本)；熒光分光光度計(F-7000型，日立公司，日本)；圓二色(CD)譜儀(MOS-450型，Bio-Logic公司，法國)；酸度計(pHS-3C型，雷磁公司，上海)；恒溫水浴鍋(HH-S2S型，江蘇揚中)。

牡荊素(純度≥94.9%，中國藥品檢定研究所)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中；α-淀粉酶(57.1 units mg-1，來自豬胰腺，Sigma公司，美國)，溶于PBS(0.1 mol·L-1，pH 6.8)中；可溶性淀粉購于西隴化工股份有限公司，取1.0 g可溶性淀粉，加10 mL超純水攪勻調成糊狀后，倒入沸水緩緩稀釋至100 mL，隨加隨攪拌，繼續(xù)煮沸2 min后，放冷，上層清液即為1%的淀粉儲備液；阿卡波糖(純度≥98%，Aladdin公司，中國)；其他實驗試劑均為分析純，所用水均為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡荊素對α-淀粉酶活性的抑制能力測定

參照WU等[9]報道的實驗方法：310 K水浴中，先在PBS溶液(0.1 mol·L-1，pH 6.8)中讓不等量的牡荊素溶液與α-淀粉酶(6.48×10-6mol·L-1)溶液20 μL孵化10 min使反應完全，再添加底物(1%可溶性淀粉)進行酶催化反應(10 min左右)。反應完全后加入1 m LDNS試劑(還原糖指示劑)并煮沸10 min顯色，流水冷卻，測定530 nm處牡荊素抑制α-淀粉酶各體系的吸光度值。阿卡波糖用作陽性對照。通過公式(1)計算α-淀粉酶的殘余酶活：

α-淀粉酶的殘余酶活=(A1-A2)/(A0-A2)×100%

(1)

A0，A1：未加入和加入牡荊素/阿卡波糖下反應體系的吸光度；A2：除未加淀粉溶液外其他試劑相同的體系的吸光度。

1.2.2 牡荊素對α-淀粉酶的抑制動力學測定

抑制可逆性：底物可溶性淀粉的濃度(0.3 mg mL-1)固定不變，在200 s內測定3組不同濃度牡荊素存在下α-淀粉酶的催化反應速率，繪制以酶催化反應速率(v=ΔOD/min)對α-淀粉酶濃度[α-amylase]的變化曲線，依據曲線的特征來判定牡荊素抑制作用的可逆性。

抑制作用的類型：在確定了抑制可逆性后，保持α-淀粉酶的摩爾濃度(1.3×10-7mol·L-1)一致，在200 s內測定三組添加了不同濃度牡荊素時的酶催化反應速率，1/v為Y軸，1/[starch]為X軸，利用米氏方程計算得到抑制常數，以及用Lineweaver-Burk雙倒數作圖，以此判斷牡荊素抑制α-淀粉酶的作用類型。

1.2.3 牡荊素與可溶性淀粉相互作用分析

參照文獻方法[10]，將不等量的牡荊素/阿卡波糖溶液(0,0.75,1.5,3.0,6.0×10-4mol·L-1)與固定量的可溶性淀粉溶液在310 K下孵化5 min，使其反應徹底，加入的KI-I2指示劑(5×10-3mol·L-1)100 μL結束反應，用UV-vis分光光度計檢測牡荊素-淀粉混合液在500～900 nm區(qū)間內的光譜。相互作用后可溶性淀粉的光譜通過差譜法獲得：ΔA=A1-A2，(A1，A2分別為添加和未加可溶性淀粉的混合體系的吸光值)。

1.2.4 熒光光譜法

控制實驗溫度(298、301、310 K)，測定滴加不同劑量牡荊素后α-淀粉酶的熒光光譜。往α-淀粉酶溶液(2.63×10-6mol·L-1)中，逐次累計滴加5.0×10-3mol·L-1的牡荊素儲備液(3 μL·次-1，共10次)，保持混勻后反應3 min，設置λEX=280 nm，狹縫寬度均是2.5 nm，測定290～500 nm牡荊素與α-淀粉酶體系的熒光發(fā)射光譜。

同步熒光測定：在實驗溫度298 K下，分別測定λem-λex=15 nm(酪氨酸，Tyr)和60 nm(色氨酸，Trp)的同步熒光光譜，其他熒光滴定條件同上。

為扣除牡荊素的紫外吸收引起的內濾光干擾，用方程(2)處理熒光數據[11]：

(2)

式中FC和FM分別是校正后和測定的熒光數據。A1和A2分別表示牡荊素在λex和λem處的吸光度值。

1.2.5 α-淀粉酶表面疏水性的測定

參照Zeng等[12]的測定方法：室溫下將α-淀粉酶(5.26×10-6mol·L-1)和指示劑苯胺基萘-8-磺酸(ANS)(1.0×10-3mol·L-1)混合孵育2 h后，逐次滴加5.0×10-3mol·L-1牡荊素溶液(3 μL/次，共10次)。在λex=380 nm，狹縫寬度均為5 nm下，掃描420～620 nm各反應液的熒光光譜，分析α-淀粉酶的表面疏水性的變化。

1.2.6 CD光譜法

配制不同濃度比的牡荊素和α-淀粉酶混合溶液，在190～250 nm范圍內掃描反應液的CD光譜(用PBS緩沖溶液進行基線校準)，牡荊素結合前后α-淀粉酶的各二級結構的含量使用在線Dichroweb程序進行分析計算。

1.2.7 分子對接及分子動力學模擬

利用Discovery Studio 2016軟件進行牡荊素和α-淀粉酶的對接模擬。分別從蛋白質數據庫和PubChem中下載α-淀粉酶晶體結構(PDB ID:1SMD)和牡荊素的3D結構。對接前，先對α-淀粉酶的晶體結構進行除水、添氫和加極性等處理，定義α-淀粉酶為受體，牡荊素為配體。根據牡荊素和α-淀粉酶對接100次后的最低CDOCKER結合能結果，兩者結合的最佳對接構象。

在GROMACS 4.5.6軟件中對α-淀粉酶和α-淀粉酶-牡荊素復合物進行分子動力學模擬，以得到小分子物質和酶相互作用過程中的各項指標變化。分別給α-淀粉酶和牡荊素分子加上不同的力場。在中和牡荊素和α-淀粉酶分子的表面電荷、最小化能量并平衡NVT和NPT后，運行分子動力學模擬30 ns。

2 結果與討論

2.1 牡荊素對α-淀粉酶的抑制作用分析

圖1A中，牡荊素和阿卡波糖以劑量依賴的方式抑制α-淀粉酶的活性，當劑量分別為1.0×10-2和2.5×10-4mol·L-1時，酶的活力能被抑制完全，但牡荊素(IC50=2.25×10-3mol·L-1)的抑制能力要弱于阿卡波糖(IC50=1.69×10-5mol·L-1)。

圖1B是以酶促反應速率(v)對α-淀粉酶的濃度所作的圖，不同濃度牡荊素存在下的擬合直線都經過了原點，且斜率與牡荊素濃度呈負相關，表明牡荊素對α-淀粉酶是可逆性抑制[13]。

確定了牡荊素對α-淀粉酶是可逆性抑制后，繪制雙倒數曲線來評價牡荊素對α-淀粉酶的抑制類型。圖2中的系列擬合直線在Y-軸相交，表明牡荊素是典型的競爭型α-淀粉酶抑制[11]。牡荊素作為競爭型抑制劑的抑制常數由下列公式計算：

(3)

(4)

[vitexin]/(10-3 mol·L-1)

c(α-amylase)=1.3×10-7 mol·L-1;c(vitexin)=0,0.5,2.0×10-3 mol·L-1 for curves a→c圖2 牡荊素抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.2 Lineweaver-Burk curve of vitexin inhibiting α-amylase

2.2 牡荊素與淀粉的結合作用

經阿卡波糖和牡荊素作用前后的淀粉，與碘液發(fā)生顯色反應的程度，在590 nm處出現淀粉-I2有色復合物的特征吸收峰(圖3)，隨著藥物分子添加量增加，阿卡波糖對淀粉與碘的顯色反應影響較小，牡荊素會減弱顯色反應程度，表明了牡荊素結合淀粉后，導致部分淀粉喪失了遇碘顯色的特性。

λ/nm

2.3 牡荊素與α-淀粉酶的結合性質

2.3.1 α-淀粉酶的熒光猝滅

α-淀粉酶在345 nm處有較強熒光，隨著牡荊素的加入，其熒光強度不斷下降(圖4A)，表明牡荊素與α-淀粉酶發(fā)生了相互作用，影響了酶的熒光基團而改變了酶的熒光特性。

Stern-Volmer方程被用于描述牡荊素對α-淀粉酶的猝滅方式：

(5)

式中F0、F分別為未添加或添加牡荊素時α-淀粉酶的熒光強度，Ksv表示熒光猝滅常數，[Q]是牡荊素的濃度，τ0表示單獨熒光團存在下的平均壽命(約10-8s)。

3個溫度下F0/F對[Q]有良好的擬合線性(圖4A插圖)，表明牡荊素通過單一方式猝滅α-淀粉酶的熒光[14]。由表1可見，Ksv值與溫度呈負相關，即溫度越高猝滅程度變弱，且各溫度下的雙分子猝滅速率常數Kq值的數量級達到1012L·mol-1·s-1，均大于小分子與生物大分子作用時的最大動態(tài)猝滅速率常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)[14]，以上結果表明牡荊素以靜態(tài)猝滅機制引起了α-淀粉酶的熒光猝滅。

2.3.2 結合常數和結合位點數

確定了靜態(tài)猝滅方式后，通過公式(6)可以計算牡荊素與α-淀粉酶相互作用時的結合常數Ka和結合位點數n[15]：

(6)

[Qt]和[Pt]分別是牡荊素和α-淀粉酶的濃度。作圖得到的結合常數Ka和n的值列于表1中。3個溫度下的Ka值分別為3.28×103、3.49×103和3.80×103L·mol-1，n值均接近于1，說明牡荊素與α-淀粉酶只有一個結合位點，結合強度中等，這與上述抑制動力學分析的結果相互佐證。

2.3.3 熱力學分析

由牡荊素與α-淀粉酶結合反應的吉布斯自由能(△G°)、熵變(△S°)和焓變(△H°)，可以確定兩者之間結合的主要作用力，由van’t Hoff方程計算[16]：

(7)

△H°=△H°-T△S°

(8)

R是氣體常數(8.314 J·mol-1·K-1)。表1中列出了計算得到的△H°、△S°和△G°值。負的△G°值，表明牡荊素結合α-淀粉酶是自發(fā)進行的；正的△H°和△S°值，表明兩者相互作用主要由疏水力驅動[16]。

表1 3個溫度下牡荊素與α-淀粉酶作用的猝滅常數(Ksv)、結合常數(Ka)、結合位點數(n)及熱力學參數Table 1 Quenching constant (Ksv),binding constant(Ka),number of binding sites(n) and thermodynamic parameters of the interaction between vitexin and α-amylase at three temperatures

2.4 牡荊素對α-淀粉酶結構的影響

2.4.1 α-淀粉酶表面疏水性變化

ANS作為特異性熒光探針去指示蛋白質的疏水性表面基團。如圖4B所示，ANS與α-淀粉酶的疏水區(qū)域結合后熒光強度顯著增強，不斷增加牡荊素濃度，α-淀粉酶-ANS復合物的熒光強度值不斷降低，說明牡荊素作用于α-淀粉酶的疏水空腔，使其表面暴露的疏水基團減少，導致ANS與α-淀粉酶疏水表面的結合受阻，而降低了酶的表面疏水性。

λ/nm λ/nm(A):c(α-amylase)=2.63×10-6 mol·L-1;(B):c(α-amylase)=5.26×10-6 mol·L-1.c(vitexin)=0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0×10-5 mol·L-1 for curves a→k,respectively.Curve l is only the spectrum of vitexin(A) or ANS(B).圖4 (A)牡荊素存在下α-淀粉酶的熒光光譜及Stern-Volmer圖；(B)不同劑量牡荊素對ANS-α-淀粉酶復合物熒光的影響Fig.4 (A) The fluorescence spectrum and Stern-Volmer plot of α-amylase in the presence of vitexin;(B) The effect of different doses of vitexin on the fluorescence of ANS-α-amylase complex

2.4.2 α-淀粉酶的同步熒光光譜分析

同步熒光光譜反映α-淀粉酶中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基疏水性和微環(huán)境極性的變化。很明顯Tyr殘基和Trp殘基的熒光強度隨著牡荊素濃度增加而猝滅(圖5A和B)，Tyr殘基的熒光峰位無明顯偏移，而Trp殘基的峰位紅移了2 nm，表明牡荊素的存在增加了α-淀粉酶的Trp殘基微環(huán)境的極性，但對Tyr殘基基本無影響[17]。計算的同步熒光的猝滅百分比(RSFQ=1-F/F0)(圖5C)表明，牡荊素對Trp殘基的猝滅百分比(74.55%)高于Tyr殘基(68.56%)，表明牡荊素猝滅α-淀粉酶熒光過程中，Trp殘基的貢獻大于Tyr殘基。

λ/nm

2.4.3 非輻射能量轉移和結合距離

相同條件下通過α-淀粉酶與HSA(已知熒光量子產率為0.13[18])的熒光強度之比，來計算α-淀粉酶的熒光量子產率：

(9)

X表示α-淀粉酶；φ代表物質的熒光量子產率；F為在λex=280 nm的熒光強度；A表示在280 nm處的吸光度值。經計算φx=0.044。根據F?rster能量轉移理論，計算牡荊素與α-淀粉酶結合過程的能量轉移效率E和兩分子間的結合距離r：

(10)

(11)

(12)

R0為當E是50%時的臨界距離，κ2是各項隨機分布的取向因子(κ2=2/3)，N為折射指數(N=1.336)，φ=φx=0.044；J是α-淀粉酶的熒光光譜和牡荊素的紫外可見光譜之間的重疊部分的積分面積，F(λ)和ε(λ)分別是在波長λ處的α-淀粉酶的熒光強度和牡荊素的摩爾吸光系數。

根據相同濃度下牡荊素和α-淀粉酶的紫外可見吸收光譜與熒光光譜曲線(圖6)，利用MGLTOOLS-1.5.6軟件計算得到兩曲線重疊面積為2.01×10-14cm3L mol-1。由公式(9)-(12)計算出R0=2.33 nm，r=3.28 nm。r<8 nm且0.5R0

λ/nm圖6 牡荊素的紫外-可見吸收光譜與α-淀粉酶的熒光光譜的重疊曲線Fig.6 Overlapping curve of the UV-Vis absorption spectrum of vitexin and the fluorescence spectrum of α-amylase

2.4.4 圓二色譜分析

α-淀粉酶分子二級結構的不對稱使其表現出圓二色性，在CD光譜遠紫外區(qū)出現較強信號。如圖7所示，α-淀粉酶的CD光譜中出現了α-螺旋的兩個特征峰(209和230 nm處負峰)[20]。隨著[牡荊素]:[α-淀粉酶]濃度比增加，兩個負峰強度減弱，說明牡荊素的加入一定程度上降低了酶的α-螺旋含量。在線分析CD光譜數據，得到α-淀粉酶各二級結構的含量列于表2中。當[牡荊素]:[α-淀粉酶]由0:1變化到1:1和3:1時，α-螺旋的含量分別降低了6.19%和9.26%，β-折疊增加了0.97%和1.46%，β-轉角增多了2.30%和5.22%。這可能是由于牡荊素破壞了α-淀粉酶蛋白骨架中螺旋結構間的氫鍵網絡，從而導致了酶α-螺旋含量減少，使酶結構變得松散[17]。

λ/nmc(α-amylase)=2.5×10-5 mol·L-1,the molar ratios of vitexin to α-amylase were 0:1,1:1,3:1,for curves a→c,respectively.圖7 牡荊素對α-淀粉酶的CD光譜的影響Fig.7 The effect of vitexin on the CD spectrum of α-amylase

表2 牡荊素對α-淀粉酶的二級結構的影響Table 2 The effect of vitexin on the secondary structure of α-amylase

2.5 牡荊素與α-淀粉酶的結合模式

2.5.1 分子對接

牡荊素與α-淀粉酶的主要結合構象可通過分子對接直觀反映。如圖8A所示，牡荊素結合到含兩個Ca2+的酶活性中心，與結合區(qū)域的Glu233、Asp197、His299、Asp300、His305、Ile235及Gly306氨基酸殘基通過疏水作用力和氫鍵作用(圖8B)，其中牡荊素的A環(huán)和C環(huán)分別與His305形成一個C-H鍵和酰胺-π堆積，B環(huán)與Ile235有π-烷基鍵，糖苷環(huán)上的-OH與Glu233、Asp197、His299間形成了4個C-H鍵和3個氫鍵(鍵長分別為：2.16，2.17，2.73 ?)，一個氫鍵存在于牡荊素A環(huán)上的C7-OH與Asp300之間，鍵長為2.77 ?，牡荊素與Glu233間的氫鍵鍵長最短，作用力最強。與酶相互作用后，牡荊素自身的構象也發(fā)生了扭曲(圖8C)，這可能是牡荊素受到酶的誘導契合，通過改變自身構象以便于進入α-淀粉酶的活性空腔[21]。對接結果表明，牡荊素結合在α-淀粉酶的活性空腔中，與底物競爭結合位點，阻礙了底物被酶催化，進而降低α-淀粉酶的活性。

圖8 (A)牡荊素與α-淀粉酶的最佳結合構象；(B)牡荊素與α-淀粉酶結合的2D圖；(C)牡荊素對接前后的構象變化Fig.8 (A) Optimal binding conformation of vitexin and α-amylase;(B) 2D image of vitexin binding to α-amylase;(C) conformational change of vitexin before and after docking

2.5.2 分子動力學模擬

分子動力學模擬直觀展示了α-淀粉酶及牡荊素-α-淀粉酶復合物結構的動態(tài)變化。α-淀粉酶-牡荊素復合物的穩(wěn)定性可用均方根偏差(RMSD)來評估，RMSD值變化越大，蛋白質骨架的振幅越大，越不穩(wěn)定[22]。如圖9A，在復合物體系中，最初15 ns內RMSD值有較大的波動，說明牡荊素與α-淀粉酶在此期間發(fā)生相互作用形成穩(wěn)定復合物。整體上牡荊素-α-淀粉酶復合物體系的RMSD值比α-淀粉酶的稍大，表明形成復合物后降低了α-淀粉酶的穩(wěn)定性。均方根波動(RMSF)體現了α-淀粉酶各氨基酸殘基在結合過程中的靈活性，RMSF值大小與各殘基的靈活性成正相關[23]。與牡荊素形成復合物后，RMSF值減小(尤其在肽段350-355降低明顯)(圖9B)，說明牡荊素與位點氨基酸結合后限制了部分氨基酸殘基的骨架原子運動?；匦霃?Rg)反映蛋白質結構的緊湊性[24]，如圖9C所示，α-淀粉酶-牡荊素復合物的Rg值先升高后下降，在Rg最大值附近，復合物的Rg值稍大于α-淀粉酶，表明牡荊素的存在誘導α-淀粉酶結構伸展，與CD分析結果吻合。溶劑可及表面積(SASA)代表體系接觸溶劑的表面積，能夠能體蛋白質表面疏水性變化[24]。從圖9D可以看出，在0～13 ns，復合物的SASA值明顯大于單獨α-淀粉酶，并呈現先升高后降低的趨勢，表明與牡荊素結合形成復合物后α-淀粉酶的表面疏水性降低，與前面ANS熒光實驗結果一致。并且通過對比Tyr和Trp殘基在模擬前后的SASA值，進一步驗證Tyr和Trp殘基微環(huán)境疏水性的變化及其對熒光猝滅的貢獻(圖9E和F)。形成復合物后，其Tyr和Trp殘基的SASA值分別降低和增加，表明牡荊素的存在增加了α-淀粉酶Tyr殘基的疏水性和Trp殘基的極性，且主要受影響的是Trp殘基，從而更多貢獻α-淀粉酶熒光猝滅，該結果同步熒光實驗結果一致。

t/ns

3 結論

研究表明牡荊素是一種競爭性α-淀粉酶抑制劑，其IC50值為2.25×10-3mol·L-1。除了能抑制淀粉酶活性之外，牡荊素還能與淀粉結合形成復合物而降低淀粉的消化。牡荊素通過的疏水作用力與α-淀粉酶在一個位點結合，這種結合誘導α-淀粉酶的α-螺旋結構含量及表面疏水性降低，使得酶的結構變得松散。牡荊素結合于α-淀粉酶含兩個Ca2+的酶活性中心，與其中的部分氨基酸殘基相互作用，且Trp殘基比Tyr殘基對兩者結合的貢獻更大。推測牡荊素抑制α-淀粉酶的分子機制是：牡荊素結合在酶的活性空腔，占據了活性位點，改變了α-淀粉酶的分子構象，阻礙了底物的進入，進而降低了α-淀粉酶的活性。