龔治安，崔靜軒，張偉偉，2，邵淑麗，2，李鐵，2

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

近幾年，基因組編輯工具的開發(fā)加速了敲除（KO）動物和敲除細胞系創(chuàng)建的進展.包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、轉錄激活因子樣效應核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇規(guī)則間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palinmic Repeats，CRISPR）/Cas9系統[1].CRISPR 及其相關蛋白（Cas）是一種RNA 引導的核酸酶，由微生物適應性免疫系統通過再利用進行基因組編輯發(fā)展而來[2].CRISPR-Cas 技術可以促進真核細胞內的高效基因組工程[3]，并且Cas9 蛋白的精確靶向是通過在其單向導RNA 內指定20 個核苷酸（nt）的靶向序列來實現的[4].將CRISPR-Cas9 基因組編輯工具應用于基因以及育種等方面，已成為科學家關注的焦點.

1977 年，Yaffe[5]等首次建立了C2C12 肌原細胞系，其可在2%馬血清培養(yǎng)條件下被誘導分化，最終形成成熟的多核肌管，并表達肌球蛋白（myosin）和肌生成素（myogein，MyoG）等成熟骨骼肌的各種標志蛋白[6].C2C12 細胞系分化速度比較快，可以形成能緊縮的微管，進而產生特異性的肌肉蛋白.C2C12 成肌細胞系的建立則為研究骨骼肌的生長發(fā)育提供了一個很好的體外模型，通過研究不同處理對細胞增殖和分化的影響，可初步揭示其在肌肉生長發(fā)育中的作用，為其它相關研究提供可靠的依據.因此，C2C12 細胞可作為研究基因調節(jié)肌肉發(fā)育的生物學功能和分子機制的良好工具.CRISPR/Cas9 基因編輯技術可對C2C12細胞中的基因進行敲除或敲入，是研究該細胞成肌分化中分子機制的主要技術手段.本文以C2C12 細胞為研究對象，對CRISPR 技術的相關應用、研究方法、結果以及對相關研究的影響等進行綜述，以期為進一步開展該領域的科學研究提供理論指導.

1 CRISPR/Cas9 編輯系統作用機制

CRISPR 于1987 年首次在大腸桿菌中發(fā)現[7]，后來在許多其它細菌中被發(fā)現[8]406.幾年來，短重復序列的作用仍不清楚，直到2005 年，幾個研究小組描述了這些序列與噬菌體DNA 的相似性，提出了這些序列是細菌適應性免疫系統一部分的假設[9-11].這些研究后來擴展到實驗證明CRISPR 及其相關蛋白（Cas）與靶向外源病毒DNA 的適應性免疫相關聯[12].機制上，2 種不同的RNA——CRISPR 靶向（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）能夠激活并引導Cas 蛋白結合病毒DNA 序列，隨后被剪切[13-14].這些CRISPR 系統的一個亞組（即Ⅱ型系統）依賴于單個Cas 蛋白靶向確定的DNA 序列，因此作為基因組編輯的工具特別有吸引力.將crRNAs 與tracrRNAs 結合成單個向導RNA（sgRNA）進一步簡化了該系統[15]816.2013 年首次利用化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，SpCas9）的Ⅱ型Cas 蛋白在哺乳動物細胞中進行RNA 引導的DNA切割，為利用CRISPR/Cas9 作為廣泛適用的基因組編輯工具奠定了基礎[16-17].在切割靶DNA 之前，Cas9 核酸酶在sgRNA 結合時發(fā)生構象變化，并指向其靶位點.結合特異性由3 個核苷酸前間隔區(qū)相鄰基序（PAM，由NGG 或NAG 序列組成）前的20 個核苷酸序列決定[15，18-19].DNA 解旋后，與PAM 結合并形成DNA-sgRNA雜交體，2 個核酸酶結構域在靶序列中引入雙鏈斷裂（DSB）[14，19]（見圖1a）.核酸酶活性的強度很大程度上是由Cas9 的結合效率決定的.對sgRNA 支架進行系統修飾，鑒定出一種優(yōu)化的支架結構，與Cas9 靶DNA 的更高結合效率相關[20].除了Cas9，其它使用替代PAM 位點（Cpf1）[21]或靶RNA（Cas13a/b）[22-23]的CRISPR II 型核酸酶已經被開發(fā)成基因組工程工具.

2 CRISPR/Cas9 系統的功能性應用研究

CRISPR/Cas9 系統在改變基因表達情況方面，利用核酸酶缺陷型SpCas9 修飾（dCas9）與其它效應結構域融合建立了多元化的體系[24]（見圖1b）.CRISPR 干擾（CRISPRi）和激活（CRISPRa）利用融合的轉錄調節(jié)因子，當dCas9 被定向到靶基因的轉錄起始位點時，抑制或誘導基因轉錄[8]406.在抑制基因轉錄方面，大多數情況下，CRISPR 干擾系統依賴于帶有KRAB 阻遏結構域的dCas9 融合來下調基因轉錄[25]445.值得關注的是，dCas9-KRAB 還可以通過改變靶位點的甲基化狀態(tài)來修飾增強子區(qū)域，從而抑制基因轉錄[26].激活基因表達的研究中，首先發(fā)現了與dCas9 融合的單個VP64 激活劑結構域，從而激活轉錄[25，27].后續(xù)通過對該系統進行改進，將VP64 改變?yōu)橐粋€三方激活劑VP64-p65-Rta（VPR）[28]或通過招募多個轉錄激活劑到dCas9，進而更加有效地激活基因的表達.除此之外，通過在dCas9 上添加長表位尾（稱為SunTag）[29]或通過修飾sgRNA 支架包括適配子來生成激活劑結構域的額外結合位點（稱為SAM）[30]，同樣也可以實現激活基因轉錄的效果.表觀遺傳學研究方面，同樣也開發(fā)了dCas9 融合蛋白進行區(qū)域特異性表觀遺傳修飾.dCas9-DNMT3A或dCas9-DNMT3A-DNMT3L融合蛋白是目前有效的CRISPRa 系統，該系統可以選擇性地增加靶向基因組區(qū)域CpG 基序的DNA 甲基化，從而抑制基因轉錄[31-33].

圖1 CRISPR/Cas9 功能

3 CRISPR/Cas9 基因編輯系統在C2C12 細胞中的應用

3.1 C2C12 細胞中基因定點敲除或敲入

CRISPR/Cas9 系統在C2C12 細胞首次被應用于構建朊病毒蛋白（PrP）敲除克隆體系[34].MOYER[35]等采用CRISPR/Cas9 體系降低C2C12 成肌細胞中Mss51的表達，該基因是肌肉生長抑制素和TGF-β1信號傳導的關鍵靶標，Mss51不調節(jié)肌母細胞增殖或分化，但是可作為肌肉生長抑制素和TGF-β1等生長因子對代謝過程的影響因素，包括脂肪酸氧化、糖酵解、氧化磷酸化.HUANG[36]等使用CRISPR-Cas9 生成了Ccndbp1-null 小鼠，Ccndbp1表達在C2C12 肌發(fā)生過程中上調.Ccndbp1過表達促進了肌發(fā)生，而Ccndbp1的敲低抑制了肌源性分化.2017 年，張凱麗[37]利用CRISPR/Cas9 技術首次實現了對小鼠成肌細胞Hnrnpk基因的敲除，并建立了利用CRISPR/Cas9 技術進行基因定點修飾的技術平臺，為后續(xù)的基因定點修飾研究提供了一定的依據.YI[38]等利用CRISPR/Cas9 技術將C2C12 細胞中Setd2基因沉默，結果顯示，肌管形成標志物Myogenin（MyoG）、肌球蛋白重鏈（MHC）在分化過程中下調，同時細胞增殖速率降低，細胞增殖缺陷、表型受損.崔亞鳳[39-40]等利用CRISPR/dCas9 技術分別激活和抑制Egrl基因的表達，結果顯示，Egr1能夠促進小鼠成肌細胞C2C12 的分化.鮑美玉[41]在探究Runx1基因對C2C12 細胞增殖和分化的影響時發(fā)現，過表達Runx1基因后，C2C12 細胞分化被促進，增殖也被促進，而利用CRISPR/Cas9 敲除Runx1基因后，C2C12 細胞分化和增殖情況則與過表達相反.LI[42]等通過構建一個過表達PFN2a的C2C12 小鼠成肌細胞系發(fā)現，PFN2a抑制增殖并促進細胞凋亡，從而下調C2C12 肌源性發(fā)育.泛素特異性蛋白酶2（USP2）被認為參與成肌細胞向肌管的分化進程，CRISPR/Cas9 生成的Usp2（KO）C2C12 細胞表現出增殖抑制、三磷酸腺苷（ATP）含量的積累和耗氧量減少[43].此外，Usp2（KO）細胞以及USP2選擇性抑制劑處理的C2C12細胞均提高了線粒體中活性氧（ROS），這提示該基因可調節(jié)線粒體的膜電位和形態(tài)，保證成肌細胞ATP的供應，進而參與增殖和分化過程.HUANG[44]等通過CRISPR/Cas9 系統構建了Mdfi過表達（Mdfi-OE）C2C12細胞系.實驗表明，Mdfi通過上調Myod，Myog，Myosin的表達來促進C2C12 細胞分化，并積極調節(jié)快速到慢速抽搐的肌肉纖維轉化[45].通過CRISPR/Cas9 介導的依賴性硫酸肝素（HS）缺失極大地損害了C2C12細胞的成肌細胞分化[46].在探究DPY19L3在C2C12 小鼠成肌細胞的肌源分化中的作用時，CRISPR/Cas9 系統進行了DPY19L3基因消耗.結果表明，DPY19L3的缺失使細胞不能被誘導分化[47].

3.2 C2C12 細胞中基因表達調控

CRISPR/Cas9 技術也廣泛應用于C2C12 細胞成肌分化過程.李浩可[48-49]等利用CRISPR/Cas9 系統構建了LRTM1基因穩(wěn)定敲除的C2C12 細胞株，MAPK/ERK通路異常激活促進了細胞的增殖，抑制了細胞的成肌分化.WANG[50]等使用CRISPR/Cas9 技術激活或抑制SPARCL1基因，結果發(fā)現，該基因激活BMP/TGF-β通路，促進C2C12 細胞的分化[51].丁聰[52]、王璐璐[53]、張聞宇[54]在探究ARID4B、FBF1、維生素A1 在C2C12細胞中的機制時都采用了CRISPR/Cas9 技術，結果發(fā)現，ARID4B是?；撬幔═au）促進C2C12 細胞增殖、蛋白質合成以及mTOR的mRNA 表達的關鍵介導分子.FBF1參與小鼠C2C12 細胞分化的過程，并且與Fas相互作用，Fas也可受FBF1的調控.外源添加維生素A1 很可能通過DHRS3催化形成維甲酸（RA）的途徑促進C2C12 成肌細胞的分化.SRIRAM[55]等發(fā)現與C2C12 細胞相比，CRISPR/Cas9 介導的C3G敲低產生的C2C12 細胞的穩(wěn)定克隆，不能正常分化，表現出Akt活性和S9-GSK3β磷酸化降低.轉錄因子CREB1是NRMT1轉錄的主要調節(jié)因子，CRISPR/Cas9 系統敲除C2C12 小鼠成肌細胞中NRMT1的表達后發(fā)現，C2C12 細胞中Pax7表達下降，影響細胞進程[56].轉錄因子ZBED6和Igf2內含子之間存在相互作用，然而當CRISPR/Cas9 介導基因敲除C2C12 成肌細胞中的miR-483 后，IGF2表達下調和細胞增殖率均降低[57].

在C2C12 細胞的肌生成抑制素（myostatin，MSTN）的研究中，CRISPR/Cas9 系統發(fā)揮了重要的作用.首先是HUANG[58]等使用CRISPR/Cas9 系統敲除小鼠C2C12 細胞系中的MSTN，并對mRNA 和miRNA 轉錄組進行測序.結果表明，MSTN的完全丟失上調了7 個miRNA，靶向有TGFB1，FOS，RB1等28 個下調基因，這些基因與腫瘤發(fā)生和細胞增殖密切相關，并且組成相互作用網絡[58-59].雙熒光素酶報告系統驗證小鼠中的MSTN是mmu-miR-1/206 的靶位點.GE[60]等利用CRISPR/Cas9 基因編輯構建MSTN3′UTR 發(fā)生突變的C2C12 細胞模型.結果顯示，該突變阻斷了MSTN的翻譯水平，并且通過抑制mmu-mir-206，可以挽救突變C2C12 細胞中MSTN蛋白的低表達.在缺血再灌注（IR）損傷的研究中，DRYSCH[61]等利用CRISPR/Cas9 基因編輯將myostatin（MSTN）缺失引入C2C12 細胞系.結果發(fā)現，C2C12-Mstn細胞在缺氧復氧（HR）作用下，MAPK/ERK激酶3/6（MEK3/6）隨p38mapk活化減弱，該實驗證實了肌肉生長抑制素對HR 中的保護作用.

3.3 C2C12 細胞中基因定點編輯

在C2C12 細胞基因改造方面，張寶[62]構建肌肉特異性表達的打靶小鼠Rosa26 位點的CRISPR/Cas9 載體，并利用CRISPR/Cas9 系統將Donor-CMV-Cas9-DsRed 與Donor-MCK-Cas9-DsRed 同源重組進入小鼠C2C12 細胞的Rosa26 位點.同樣，王曉萌[63]等利用CRISPR/Cas9 系統以及肌肉特異性啟動子SP，通過打靶小鼠C2C12 細胞中Rosa26 位點，成功構建了肌肉特異性表達的Cas9 載體PX459-Rosa26-SP 和肌肉特異同源打靶示蹤載體Donor-Cas9-SP-DsRed.STEIL[64]等在C2C12 細胞中模擬CALM1基因的1 個或2 個等位基因中蛋氨酸氧化為蛋氨酸亞砜，利用CRISPR/Cas9 系統引入了一個氨基酸替換M109Q.結果顯示，1 個或 2 個等位基因發(fā)生CALM1M109Q 突變的細胞無法退出細胞周期，未能表達晚期肌源性因子.GóMEZ-DOMíNGUEZ[65]等在小鼠C2C12 成肌細胞中，利用CRISPR/Cas9 技術在位于LMNA外顯子4上構建了40 多個突變體，結果在突變體中檢測到顯著的肌源性分化缺陷.

這些研究實驗均獲得了具有純合突變的單細胞克隆和有效的基因敲除或過表達載體，并構建了相應基因的細胞系，并驗證了許多參與C2C12 細胞成肌分化的轉錄因子（見圖2），為后續(xù)通過不同方法制備基因突變小鼠個體提供了材料以及理論依據.

圖2 利用CRISPR/Cas9 技術驗證參與C2C12 成肌分化的調控基因

4 結語

CRISPR/Cas9 基因編輯技術通過不斷完善已經發(fā)展為一項穩(wěn)定的基因編輯手段.本文闡述的研究結果表明，CRISPR/Cas9 系統被廣泛應用于小鼠C2C12 細胞基因編輯的多個方面，并驗證了大量參與C2C12 細胞成肌分化的轉錄因子.但從技術層面考慮CRISPR/Cas9 基因編輯技術還存在嚴重的脫靶問題，這應當是在后期研究過程中重點完善的部分.在C2C12 細胞的實驗結果也為構建特異性基因突變小鼠以及肌細胞增殖分化的研究提供更多的理論參考.CRISPR/Cas9 就技術而言已經達到成熟階段，而且基于Cas9 的單堿基基因編輯技術也已經出現，這樣基因編輯精確性在理論層面被提升到了極高的水平，其應用前景極其可觀.基于CRISPR 強大的基因編輯功能，在臨床研究中篩選疾病關鍵基因、癌癥免疫療法以及遺傳疾病治療等方向都具有巨大潛力.除了Cas9 系統之外，Cas12/13 技術也逐漸成熟，但目前僅能在實驗室中應用，大規(guī)模商業(yè)化應用較困難.目前可以預見的是，CRISPR/Cas9 系統會更加深入和廣泛地被應用于各種細胞以及動物的基因編輯研究方面，這將加快農業(yè)育種、醫(yī)學研究和臨床疾病治療等方面的研究取得突破性進展.同時，同家族的Cas12/13 技術成熟也將成為未來基因編輯技術發(fā)展中的重要篇章.