張佳睿，張丹丹，李佳樂，李晨陽，楊鎮(zhèn)才，李珊珊，劉麗杰，李波

（齊齊哈爾大學(xué) 1.生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是豆科重要的牧草，其具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力及生態(tài)功能，對我國生態(tài)環(huán)境的建設(shè)及改善具有積極作用[1].我國對苜蓿的應(yīng)用主要集中在上游產(chǎn)業(yè)，對其次生代謝產(chǎn)物的生物學(xué)功能活性研究相對較少.隨著研究人員對紫花苜蓿的深入研究，人們對其營養(yǎng)價(jià)值有了一定的了解，以苜蓿為原料的食品和保健品逐漸被人們所接受.作為畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)質(zhì)飼草，紫花苜蓿在生長過程中會積累皂苷、黃酮類、香豆素等多種次生代謝產(chǎn)物[2]，主要儲藏在苜蓿的莖、葉、根等部位.在對紫花苜蓿的開發(fā)利用中，目前從中提取出的黃酮類化合物已高達(dá)50 余種，所表現(xiàn)出來的生理、藥理活性也與其含有較多的黃酮類化合物密切相關(guān)[3].

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類較多，各種植物中的黃酮類物質(zhì)具有較大差異[4-5].依據(jù)黃酮類化合物的特點(diǎn)可選擇相應(yīng)的提取方法，常用的提取方法有浸提法、回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[6-8].其中，微波輔助提取法是微波與有機(jī)溶劑萃取相結(jié)合的產(chǎn)物，利用電磁加熱原理，使微波穿透有機(jī)溶劑，直接作用于萃取材料，提高植物活性物質(zhì)的萃取效率.微波輔助提取法提取效率高、速度快、對植物活性物質(zhì)的產(chǎn)物得率較高[9]，可有效保存食品、藥品及其它物料中的有效成分.微波提取過程受物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波提取時間等不同因素的影響.本文以龍牧801 紫花苜蓿干粉為材料，設(shè)計(jì)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化微波輔助提取苜?？傸S酮工藝，為開發(fā)利用苜蓿提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1 材料預(yù)處理

以龍牧801紫花苜蓿為原材料，于盛花期收割其地上部分，置于避光通風(fēng)處自然陰干，篩去砂礫、草棒、枯草等雜質(zhì)，陰干后用高速多功能粉碎機(jī)將干草粉碎成草粉，置于密封盒內(nèi)避光備用.

1.2 儀器與試劑

高速多功能粉碎機(jī)（YB-1500A，永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；微波爐（S7G88C，蘇州三星電子有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；全溫振蕩搖床（ZD-88，常州金壇中旺儀器制造有限公司）；循環(huán)水真空泵（SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）.

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；石油醚（60～90℃，遼寧泉瑞試劑有限公司）；無水乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，九水硝酸鋁（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）.以上試劑均為分析純（AR）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液，以NaNO2-Al（NO3）3為顯色劑，在λ=510 nm測定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得回歸方程為A=13.893C-0.005 9（R2=0.997 3），總黃酮在質(zhì)量濃度為0.008～0.048 mg/mL時有良好的線性關(guān)系.

2.2 單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 基本實(shí)驗(yàn)條件 物料比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波功率800 W，微波提取時間30 s.

2.2.2 每個單因素設(shè)計(jì) 選取4 個單因素（物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波提取時間），每個單因素設(shè)置5 個水平，其中物料比（g∶mL）為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50；乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%；微波功率為180，300，450，600，800 W；微波提取時間為10，20，30，40，50 s.每組單因素實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次.

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個因素選擇3 個水平，按L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)（見表1），得出優(yōu)選因素組合，確定微波輔助法提取紫花苜?？傸S酮最優(yōu)工藝.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

2.3 總黃酮的提取和含量測定

按照設(shè)定的物料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在室溫、120 r/min條件下震蕩浸泡1 h，使苜蓿中總黃酮類物質(zhì)充分溶出，浸泡完畢后進(jìn)行微波處理.在微波爐轉(zhuǎn)盤中央放置一個裝有適量自來水的大燒杯用于吸熱，將裝有待提取樣本的三角瓶圍繞大燒杯周圍依次擺放，按照設(shè)定好的參數(shù)進(jìn)行微波處理，每次微波處理10 s后將三角瓶取出，降至室溫后再進(jìn)行下一次微波處理，直至達(dá)到規(guī)定時間，每組處理3次重復(fù).過濾得浸提液，將浸提液加入等體積的石油醚萃取，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸發(fā)至膏狀物，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇重新定容至50 mL，取5mL置容量瓶中，再按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法進(jìn)行顯色和OD值測定.

依據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮提取量，Y=cVn m，其中：c為總黃酮的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V為總黃酮提取液的體積（mL）；n為提取液稀釋的倍數(shù)；m為苜蓿草粉的質(zhì)量（g）.

2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.00 g 備用苜蓿干粉4份，以最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測其吸光度，并計(jì)算總黃酮提取量.

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS19.0分析軟件對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）.

3 結(jié)果與分析

3.1 微波輔助提取法各單因素對苜?？傸S酮提取量的影響

微波輔助提取法對苜蓿總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.由圖1可見，隨著物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率和微波提取時間的增加，苜?？傸S酮提取量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢.

圖1 微波輔助提取的4個因素對苜?？傸S酮提取量的影響

當(dāng)物料比從1∶10 增加至1∶20 時，苜?？傸S酮提取量快速上升，物料比超過1∶20時，總黃酮提取量趨于平緩，當(dāng)物料比達(dá)到1∶30 時，苜?？傸S酮提取量最高，為2.245 mg·g-1.繼續(xù)增加物料比時，由于提取溶劑的增加降低了苜?？傸S酮的提取量，可能是細(xì)胞液對微波能量吸收減少，微波作用力變?nèi)鮗10]，導(dǎo)致細(xì)胞破裂不完全，總黃酮提取量下降.物料比1∶10，1∶50 苜蓿總黃酮提取量與物料比1∶20，1∶30，1∶40之間苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

在乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%范圍內(nèi)，總黃酮提取量呈現(xiàn)先平穩(wěn)緩慢增長，后劇烈下降的趨勢.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時，總黃酮提取量無明顯差異，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，苜?？傸S酮提取量達(dá)最大值，為2.050 mg·g-1.繼續(xù)升高乙醇濃度，苜?？傸S酮提取量迅速下降，可能是過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)影響一些黃酮類成分的溶解性[11].40%，50%，60%與70%，80%苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

微波功率在300～450 W 時，苜?？傸S酮提取量提高尤為明顯，總黃酮提取量峰值出現(xiàn)在微波功率450 W條件下，最高提取量為1.789 mg·g-1.當(dāng)微波功率大于450 W 時，苜?？傸S酮提取量逐漸下降，微波功率過高，會導(dǎo)致某些黃酮類結(jié)構(gòu)的變性或者降解[12]，使總黃酮提取量降低.除微波功率為450 與600 W，180與800 W，300 與600 W 外，其它各處理間苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

當(dāng)微波提取時間為10～30 s 時，隨著微波提取時間的延長，苜?？傸S酮的提取量迅速提高，在微波提取時間為30 s 時，苜蓿總黃酮提取量最高，為1.916 mg·g-1.但繼續(xù)延長微波提取時間，苜蓿總黃酮提取量反而下降，可能是隨著微波提取時間的延長增加了其它非黃酮類化合物的溶出[13]，影響了總黃酮提取量.除20 與50 s 微波提取時間外，其它各微波提取時間內(nèi)苜?？傸S酮提取量比較差異顯著（P＜0.05）.

3.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取條件

根據(jù)微波輔助提取法的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2.極差（R）值越小該因素對苜蓿總黃酮提取量的影響程度越小，R值越大該因素對苜?？傸S酮提取量的影響越大，影響苜蓿總黃酮提取量的4 因素R值大小依次為C＞D＞B＞A，即微波功率的影響最大，其次為微波提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和物料比.由方差（K）值大小可知，當(dāng)物料比為1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、微波功率為450 W 和微波提取時間40 s 時提取效果最好，從而得出最佳提取工藝為A2B3C2D3.綜合分析得出微波輔助法提取苜蓿總黃酮最佳工藝水平組合為物料比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率為450 W、微波提取時間40 s.

表2 微波輔助法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用正交實(shí)驗(yàn)分析軟件對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.由表3 可見，物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率和微波提取時間對苜蓿總黃酮提取量的影響均達(dá)到顯著水平.

表3 苜?？傸S酮提取量正交實(shí)驗(yàn)方差結(jié)果分析

3.3 微波輔助提取苜?？傸S酮的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)最佳組合提取工藝條件下進(jìn)行4 次平行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn).準(zhǔn)確稱取1 g 苜蓿干粉末，以物料比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，微波功率為450 W，微波提取時間40 s 進(jìn)行微波輔助提取，測定結(jié)果見表4.在最佳組合工藝提取條件下，4 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，且高于單因素及正交實(shí)驗(yàn)中的總黃酮提取量，苜?？傸S酮的平均提取量為2.179 mg·g-1，說明微波輔助法提取苜蓿中總黃酮的優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠.

表4 微波輔助提取法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

植物生長發(fā)育過程產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物大量存在于根、莖、葉等器官中，這些產(chǎn)物的含量直接影響對其開發(fā)和利用.黃酮類物質(zhì)屬于植物次生代謝產(chǎn)物的一種，近年來，關(guān)于植物中黃酮類化合物的提取研究得到了長足的發(fā)展，多采用微波輔助、超聲波輔助和響應(yīng)面等提取法提高黃酮類化合物的提取效率[14].

前人在利用微波輔助提取黃酮類化合物時，對影響黃酮類化合物提取效率的各單因素進(jìn)行了不同水平的比較，在此基礎(chǔ)上對各因素的互作效率進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化黃酮類化合物的提取工藝.有關(guān)苜?？傸S酮提取的工藝研究中，普遍認(rèn)為微波輔助提取法提取紫花苜?？傸S酮的提取效率較高，但不同研究者在物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波提取時間等因素對黃酮提取量的影響研究上略有差異.張?jiān)伱穂15]等通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的方法，優(yōu)化微波輔助提取紫花苜?？傸S酮的提取工藝，認(rèn)為影響提取量的主要因素是物料比和乙醇濃度，在最優(yōu)工藝下（1∶30物料比，40%乙醇體積分?jǐn)?shù)，微波功率500 W，作用時間60 s）的總黃酮提取量為4.88 mg·g-1.與本文在微波輔助提取苜?？傸S酮的影響因素的結(jié)果存在差異，物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波提取時間均顯著影響苜蓿總黃酮提取量，其中微波功率的影響最大；但在最優(yōu)提取工藝上物料比和微波功率的篩選上基本一致，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波處理時間上略有差異，導(dǎo)致本研究苜?？傸S酮量低的原因可能是材料的選擇和微波處理功率方面.實(shí)驗(yàn)研究可為紫花苜蓿資源利用方面提供有價(jià)值的參考依據(jù).

5 結(jié)論

在微波輔助提取苜?？傸S酮時，物料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、微波提取時間均對苜?？傸S酮提取量產(chǎn)生顯著影響，微波功率＞微波提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞物料比.最佳提取工藝為：物料比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率450 W、微波提取時間40 s，此工藝條件下苜?？傸S酮提取量為2.179 mg·g-1，提取工藝穩(wěn)定.