朱 越，廖澤彬，沈 歆，梅 雨，薛夢(mèng)琪，高 月

0 引 言

惡性腫瘤已成為人類(lèi)死亡的最主要原因，對(duì)于胸部腫瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等，除了傳統(tǒng)手術(shù)切除外，放射療法是其最主要的治療措施[1-3]。但在放療過(guò)程中，射線(xiàn)不可避免地?fù)p傷肺部正常組織，從而誘發(fā)放射性肺損傷, 嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量。放射性肺損傷的早期表現(xiàn)是放射性肺炎，病理表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷并釋放炎性因子，炎性因子的累積進(jìn)一步加劇肺部炎性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)癥狀為漸漸加重的咳嗽、咳痰和活動(dòng)后氣急[4]。放射性肺炎具有自限性，輕者無(wú)需治療，重者需停止放射治療、使用激素、氧療和抗感染等對(duì)癥治療。然而，如炎癥階段前期得不到有效控制，后期將會(huì)不斷反復(fù)，進(jìn)而發(fā)展成為不可逆的放射性肺纖維化，最終導(dǎo)致呼吸功能損害，甚至呼吸衰竭[5-6]。由于目前臨床上僅能通過(guò)使用大劑量糖皮質(zhì)激素減輕放射性肺炎患者的咳嗽、發(fā)熱等癥狀，但激素使用后的副作用大，特別是對(duì)激素耐受的患者[7]。亟需研發(fā)高效低毒的藥物，來(lái)滿(mǎn)足放療患者對(duì)放射性肺炎的防治需要。

基于放射性肺炎的病理機(jī)制，科學(xué)家們對(duì)有潛在防護(hù)作用的中醫(yī)藥進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)桑杏護(hù)肺顆粒通過(guò)調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞平衡減輕大鼠放射性肺損傷的癥狀[8]；加味麻杏石甘湯通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路從而減輕放射性肺纖維化[9]；另外，丹參川芎嗪注射液、百令膠囊等被證明對(duì)放射性肺炎有防治作用[10-14]。這些藥物與激素聯(lián)合使用，其效果也好于單獨(dú)使用激素，且副作用小。

薏苡仁油為從薏苡仁中有效成分提取的新型脂肪乳劑(康萊特注射液)。臨床上主要用于治療原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌和原發(fā)性肝癌，和化療藥物合用，有一定增效作用[15]，且能減輕放化療的副反應(yīng)。常用于減輕癌癥患者疼痛[16]，有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[17]。由于在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常被用于清解熱毒，是一種潛在的放射性肺損傷防治藥物。本研究旨在對(duì)薏苡仁油對(duì)放射性肺損傷中早期階段的放射性肺炎的防治作用進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，54只，七周齡，18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2021-0006，動(dòng)物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物房，飼養(yǎng)于12 h晝夜交替環(huán)境中，溫度濕度恒定。小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：正常對(duì)照組、輻照組、薏苡仁油組(腹腔注射)，每組18只，分為3個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段各6只。

1.2照射源及主要儀器60Coγ射線(xiàn)照射源由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供；酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司)，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(Sysmex2000i)，脫水機(jī)(日本櫻花，型號(hào)：VIP-5)，包埋機(jī)(金華科迪，型號(hào)：KEDEE KD-TK),切片機(jī)(萊卡，型號(hào)：RM2235)，組織攤片機(jī)(金華科迪，型號(hào)：KEDEE KD-TK)，全景切片掃描儀(江豐生物，型號(hào)：KFBIO KF-PROP-120)，病理分析軟件K-VIEWER1.5.3.1(江豐生物)。

1.3藥品與實(shí)驗(yàn)試劑薏苡仁油(康萊特注射液，浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970091 ,批號(hào)：2012187-1)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(北京成志科為生物技術(shù)有限公司)。4%多聚甲醛(biosharp，規(guī)格：BL539A)，病理專(zhuān)用石蠟(世泰)，Hariss蘇木精(珠海貝索，規(guī)格：BASO BA4023)，伊紅(珠海貝索，規(guī)格：BASO BA4022)。

1.4輻照方法小鼠于照射前30min經(jīng)腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉后，每6只為一組，固定于專(zhuān)用照射臺(tái)上，小鼠放在距離照射源1.5m處，并使用10cm厚鉛磚對(duì)除胸部以外區(qū)域進(jìn)行屏蔽，只保留胸部區(qū)域暴露，輻照野1.5 cm×22 cm，照射劑量率1.41 Gy/min，照射總劑量為25 Gy。正常對(duì)照組不做處理。

1.5小鼠給藥正常對(duì)照組、輻照組均腹腔注射大豆油，體積與薏苡仁油組一致，薏苡仁油組使用康萊特注射液腹腔注射給藥3 g/(kg·d)，各組于照射后連續(xù)給藥14 d。

1.6小鼠外周血象檢測(cè)輻照結(jié)束后，于2、4、8周時(shí)每組處死6只，對(duì)小鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞數(shù)量(WBC)。

1.7肺部組織病理觀察輻照結(jié)束后，于2、4和8周時(shí)每組處死6只，對(duì)小鼠進(jìn)行取材。取小鼠左側(cè)肺葉，置于4%多聚甲醛中浸泡48 h，脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色后，全景切片掃描儀掃描，使用病理觀察軟件K-VIEWER進(jìn)行觀察，選擇100倍進(jìn)行觀察。

1.8肺組織內(nèi)炎癥因子測(cè)定輻照結(jié)束后，于2、4和8周時(shí)每組均處死6只小鼠并進(jìn)行取材。取小鼠肺組織，稱(chēng)量后進(jìn)行組織勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graphpadprism 8.4.3(Graphpad Software Inc.La Jolla , USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，3組及以上采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)得出是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中，以P≤0.05被認(rèn)為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 薏苡仁油對(duì)胸部照射的小鼠外周血象的影響與正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間相比，輻照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降(P<0.05)。與輻照組相比，薏苡仁油組(KLT)在4周時(shí)，能顯著提升小鼠白細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，2周及8周時(shí)也有所上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05， **P<0. 01；與輻照組比較，#P<0.05

2.2薏苡仁油對(duì)胸部照射后小鼠肺部組織病理的改變正常對(duì)照組各時(shí)段肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡、血管、氣腔關(guān)系正常，肺泡上皮未見(jiàn)不典型性改變，未見(jiàn)明確白細(xì)胞浸潤(rùn)；輻照組2周后可見(jiàn)輕度肺炎，肺泡間隔增寬，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。輻照4周后肺炎程度加深，可見(jiàn)肺泡塌陷，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，毛細(xì)血管出血。輻照8周后發(fā)展為重度肺炎，肺泡塌陷實(shí)變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，并有輕度纖維化改變。薏苡仁油組和輻照組相比，在輻照后各個(gè)時(shí)間段均表現(xiàn)出較好的炎癥抑制作用，在輻照4周和8周后也能夠維持肺泡結(jié)構(gòu)的完整性。見(jiàn)圖2。

圖 2 輻照后小鼠肺部組織病理學(xué)形態(tài)變化(HEx100)

2.3薏苡仁油對(duì)胸部照射小鼠肺部細(xì)胞因子的影響胸部輻照后2周、4周和8周，相比于正常對(duì)照組，輻照組小鼠肺部IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6各有不同程度的升高(P<0.05)。IL-18在照射后2周，輻照組與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。在照射后4周及8周，輻照組IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.05)。在輻照后給予薏苡仁油，4周和8周時(shí)薏苡仁油組能顯著下調(diào)IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。2周時(shí)各指標(biāo)均有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 60Coγ射線(xiàn)輻照2周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

表 2 60Coγ射線(xiàn)輻照4周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

表 3 60Coγ射線(xiàn)輻照8周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

3 討 論

腫瘤治療應(yīng)優(yōu)先選擇手術(shù)。對(duì)一些失去手術(shù)機(jī)會(huì)，或術(shù)后復(fù)發(fā)，晚期擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移等，放射療法是一種常用手段。但是，在放療殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，射線(xiàn)也會(huì)對(duì)周?chē)５慕M織和器官造成損傷[18]。肺癌、乳腺癌等胸部腫瘤在放療后，大約50%患者會(huì)產(chǎn)生放射性肺損傷[19]。久而久之，不少患者還會(huì)發(fā)展成放射性肺纖維化，這就給放射治療帶來(lái)難題。另外，放射療法另一副反應(yīng)，就是骨髓的抑制，導(dǎo)致外周血象、白細(xì)胞的減少。造血系統(tǒng)對(duì)輻照極度敏感，外周血白細(xì)胞降低不僅提示造血系統(tǒng)損害，更影響機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘發(fā)感染。

中藥薏苡仁，具有利水滲濕、清熱解毒、消腫散結(jié)等功效。而薏苡仁油為薏苡仁提取物，是薏苡仁的主要有效成份。本研究以C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)60Coγ射線(xiàn)進(jìn)行胸腔局部照射建立放射性肺炎損傷模型，探索薏苡仁油對(duì)放射性肺炎的防治作用。

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，除正常對(duì)照組外，輻照組各個(gè)時(shí)間段，其白細(xì)胞水平下降，尤其在輻照后的兩周，外周白細(xì)胞的數(shù)量下降到正常對(duì)照的1/3左右。而在相同條件下，給予薏苡仁油腹腔注射處理的小鼠，其白細(xì)胞下降的幅度及速度，明顯優(yōu)于輻照組。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，薏苡仁油對(duì)輻照小鼠白細(xì)胞急速下降的保護(hù)作用，一方面來(lái)自于骨髓對(duì)白細(xì)胞的制造能力增加，另一方面減緩白細(xì)胞的凋亡速度。

病理變化方面,在輻照兩周左右，小鼠放射性肺炎即有所表現(xiàn)，主要為肺泡間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4周左右炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血、肺間質(zhì)水腫；8周左右可見(jiàn)肺泡塌陷實(shí)變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。在給予薏苡仁油后，各個(gè)時(shí)間段均出現(xiàn)了較好的炎癥抑制作用。藥效作用在4周以后效果更為顯著，表現(xiàn)在肺泡的滲出明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肺泡的結(jié)構(gòu)完整性也比輻照組好。

放射性肺炎的發(fā)病機(jī)制和影響因素眾多，主流觀點(diǎn)認(rèn)為，當(dāng)肺部經(jīng)受電離輻射后，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引發(fā)肺泡屏障功能受損[20]。在輻照后幾天至幾周內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)，包括肺部炎性滲出增多、毛細(xì)血管通透性變差、細(xì)胞因子大量釋放[21]。巨噬細(xì)胞的累積又進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生諸如氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS；促炎因子IL-1β以及一些促纖維化因子等。這些細(xì)胞因子的釋放和積聚如長(zhǎng)期得不到控制，不僅易產(chǎn)生炎性風(fēng)暴，還會(huì)導(dǎo)致放射性肺炎由急性向慢性轉(zhuǎn)化，最終發(fā)展成不可逆的放射性肺纖維化。

輻照組小鼠肺組織IL-1β、IL-18和TNF-α各個(gè)時(shí)間段有不同程度的升高，IL-6在照射后4周及8周，表達(dá)顯著升高，與正常對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在照射后給予薏苡仁油處理，4周和8周時(shí)薏苡仁油組能顯著下調(diào)IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，放射性肺炎的發(fā)生與IL-1β、IL-6和TNF-α的 高表達(dá)息息相關(guān)，在防治放射性肺炎過(guò)程中十分關(guān)鍵[22-25]。因此，薏苡仁油能夠顯著下調(diào)胸部大劑量照射所導(dǎo)致的小鼠肺部炎癥因子紊亂，進(jìn)一步提示薏苡仁油對(duì)放射性肺炎的防治作用。

綜上所述，薏苡仁油可以升高輻照后小鼠白細(xì)胞總數(shù)，抑制肺泡結(jié)構(gòu)性改變，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的釋放從而達(dá)到減輕放射性肺炎的效果，對(duì)放射性肺損傷尤其是放射性肺炎產(chǎn)生一定的防治作用。