李育敏，龔海娜，付曉歌，曾子郎，郭東月，姚潔儀，李雙，張秀明

(深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學(xué)檢驗實驗室&深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518001)

2021年8月，《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識》發(fā)布[1]，提出新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)核酸快速檢測是常規(guī)檢測的補充，在因特定原因需盡快獲得檢測結(jié)果、待檢人群數(shù)量較少、實驗室空間場地限制的情況下，可考慮采用快速檢測。為貫徹落實國家對發(fā)熱門診、機場、海關(guān)、口岸、火車站等場景需要快速出具核酸檢測報告的疫情防控策略，新型冠狀病毒核酸快檢迅速在上述各機構(gòu)開展起來。核酸快檢技術(shù)雖然明顯縮短了檢測時間，使陽性感染者能夠得到快速有效的管控，降低其繼續(xù)傳播病毒的風(fēng)險，但是同樣也面臨著檢測靈敏度和特異性的問題，尤其是單靶標(biāo)陽性結(jié)果，需要再次進行復(fù)核[1]，增加了檢出的時間。因此，實驗室為確保核酸快檢結(jié)果及時、準(zhǔn)確，需做好質(zhì)量控制(質(zhì)控)和結(jié)果判讀。本研究對收集到的核酸快檢單靶標(biāo)陽性結(jié)果進行分析探討，以期為臨床實驗室檢測和結(jié)果判讀、復(fù)核及解釋提供參考。

1 材料與方法

1.1樣本 收集2021年1月1日至2022年8月16日在深圳市羅湖醫(yī)院集團醫(yī)學(xué)檢驗實驗室采用快檢試劑檢測的咽拭子標(biāo)本，所有樣本均為單獨采樣。嚴(yán)格按照醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)和新型冠狀病毒肺炎防控方案(第九版)要求[2-3]進行樣本采集、送檢和保存。

1.2試劑與儀器 核酸提取試劑盒(磁珠法，重慶中元匯吉公司)，新型冠狀病毒2019-nCoV核酸快檢試劑盒(熒光PCR法，達安基因公司)，新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，上海伯杰公司)。EXM6000全自動核酸提取儀(重慶中元匯吉公司)，AGS8830-8型和AGS8830-16型實時熒光定量PCR儀(杭州安譽公司，用于核酸快檢)，SLAN-96S熒光定量PCR儀(上海宏石公司，用于核酸常規(guī)檢測)。

1.3標(biāo)本處理和檢測 將病毒采樣管置于振蕩器上，振蕩10 min，分別采用快檢(達安試劑)和常規(guī)檢測(伯杰試劑)2種方法進行平行檢測。按照核酸提取試劑盒說明書進行核酸提取，按照核酸擴增檢測試劑盒說明書進行核酸擴增。

1.4結(jié)果判讀

1.4.1室內(nèi)質(zhì)控 3份陰性質(zhì)控檢測結(jié)果均為陰性，1份弱陽性質(zhì)控結(jié)果為陽性，且Ct值符合預(yù)期值，視為室內(nèi)質(zhì)控在控，否則為失控。質(zhì)控在控時檢測數(shù)據(jù)可接受。

1.4.2達安快檢試劑結(jié)果判斷 (1)如果檢測樣本在FAM和VIC通道無擴增曲線或Ct值>30，且Cy5通道有擴增曲線、Ct值≤30，可判斷樣本為2019-nCoV陰性。(2)如果檢測樣本在FAM和VIC通道Ct值≤30，且有明顯的擴增曲線，Cy5通道有或無擴增曲線，可判樣品為2019-nCoV快檢結(jié)果陽性。(3)如果出現(xiàn)以下2種情況，結(jié)果須復(fù)檢(同試劑)：a.檢測樣本僅在 FAM或VIC單一通道Ct值≤30，另一通道Ct值>30或無擴增曲線，Cy5通道有或無擴增曲線；b.檢測樣本在FAM通道Ct值>30或無擴增曲線，VIC通道Ct值>30或無擴增曲線，Cy5通道Ct值>30或無擴增曲線。復(fù)檢結(jié)果判定：內(nèi)標(biāo)Ct值>30或無擴增曲線樣本需重新取樣檢測。

1.4.3伯杰試劑結(jié)果判斷 (1)如果檢測樣本在FAM和VIC通道Ct值>40，ROX通道Ct值≤40，可判斷樣本為2019-nCoV陰性。(2)如果檢測樣本在FAM、VIC、ROX通道Ct值≤40，且曲線有明顯的擴增曲線，可判樣品為2019-nCoV陽性。(3)如果檢測樣本在FAM或者VIC通道Ct值≤40，另一通道無Ct值或大于40，須復(fù)檢(同試劑)，復(fù)檢結(jié)果與原結(jié)果一致，可判讀為2019-nCoV陽性，否則為陰性。如快檢和常規(guī)檢測均為單靶標(biāo)陽性，送深圳市疾控中心(CDC)和深圳市羅湖區(qū)CDC復(fù)核。

1.4.4CDC復(fù)核 CDC對初篩陽性樣本采用2種常規(guī)檢測試劑(達安基因公司和上海伯杰公司)進行復(fù)核。

2 結(jié)果

2.1檢測概況 經(jīng)CDC復(fù)核，實驗室通過核酸快速檢測，共檢出陽性257例，其中單靶標(biāo)陽性38例(表1)，CDC復(fù)核結(jié)果為陽性或建議重新采樣，包括12例復(fù)陽；其中單靶標(biāo)N基因陽性有20例，單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性18例，建議重新采樣的6例標(biāo)本中，5例為復(fù)陽標(biāo)本。

2.2單靶標(biāo)N基因陽性 20例單靶標(biāo)N基因陽性結(jié)果的Ct值為26.48～31.06，其中10例為復(fù)陽；經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測，其中13例結(jié)果為雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)陽性，包括5例復(fù)陽；7例仍為單靶標(biāo)N基因陽性，包括5例復(fù)陽，見表1。

2.3單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性 18例單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性結(jié)果的Ct值為27.17～30.01，其中2例為復(fù)陽；經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測，其中11例結(jié)果為雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)陽性，5例結(jié)果為單靶標(biāo)N基因陽性(包括2例復(fù)陽)，2例仍為單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性，見表1。

表1 38例新冠病毒核酸快速檢測單靶標(biāo)陽性結(jié)果

3 討論

按照《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識》[1]，新冠病毒快檢結(jié)果為陽性，應(yīng)使用另外1～2種更為靈敏且擴增不同靶區(qū)域的常規(guī)核酸檢測試劑對原始樣本進行復(fù)檢，復(fù)核陽性方可報告結(jié)果。本實驗室在前期對核酸快檢系統(tǒng)進行性能驗證的研究中發(fā)現(xiàn)，在廠家聲明的檢出限500 copies/mL濃度水平重復(fù)測定20次，雙靶標(biāo)(ORF1ab和N基因)的檢出率僅為65%，這是由于其中單靶標(biāo)N基因的檢出率為20/20，而單靶標(biāo)ORF1ab基因為13/20；快檢和常規(guī)檢測2種方法陽性符合率為82.4%[4]，這表明針對弱陽性標(biāo)本，快檢系統(tǒng)檢出率低于常規(guī)檢測。本研究中38例快檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測有24例為雙靶標(biāo)陽性，這也提示常規(guī)試劑的靈敏度較快檢系統(tǒng)更高。因此，建議對有中高風(fēng)險地區(qū)的城市來源的人群，如口岸入境人員等，可同時進行快檢和常規(guī)PCR 2種方法擴增，一方面確保檢測結(jié)果及時，對陽性人員采取“早發(fā)現(xiàn)、早報告、早隔離”的措施；另一方面可避免弱陽性標(biāo)本的漏檢，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

目前國內(nèi)大部分核酸檢測方法主要針對N基因和ORF1ab基因設(shè)計特異性引物和熒光探針。在新冠病毒基因組中，N基因相對保守，而ORF1ab基因特異性強，是病毒鑒定的重要標(biāo)志物[5]。本研究檢出的38例經(jīng)CDC復(fù)核后的快檢單靶標(biāo)陽性標(biāo)本中，單靶標(biāo)N基因陽性20例，經(jīng)常規(guī)試劑平行檢測，13例為雙陽，7例仍為N基因單陽；單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性有18例，常規(guī)試劑平行檢出11例為雙陽，5例為N基因單陽(包括2例復(fù)陽)，2例仍為ORF1ab單陽。20例快檢N基因單陽中有10例為復(fù)陽；18例快檢ORF1ab基因單陽中，僅2例為復(fù)陽，這提示臨床應(yīng)高度重視快檢單靶標(biāo)ORF1ab基因初篩陽性的結(jié)果。在核酸檢測過程中，由于受ORF1ab基因的拷貝數(shù)和特異性，以及試劑對ORF1ab基因和N基因的檢測靈敏度差異影響，通常觀察到的現(xiàn)象是單靶標(biāo)N基因的陽性率高于單靶標(biāo)ORF1ab基因[6-9]，而且還需注意單靶標(biāo)N基因陽性是否為非特異的假陽性，當(dāng)出現(xiàn)多個單靶標(biāo)陽性的時候應(yīng)考慮是否發(fā)生污染。本研究提示發(fā)現(xiàn)快檢單靶標(biāo)ORF1ab基因陽性時，排除非特異因素，應(yīng)高度警惕其檢測結(jié)果為真陽性的可能，需及時進行常規(guī)試劑復(fù)核，以便盡早報告結(jié)果。

本研究有12例快檢單靶標(biāo)陽性為復(fù)陽，其中有快檢結(jié)果為一種單靶標(biāo)陽性，而常規(guī)檢測為另一種單靶標(biāo)陽性的情況，也有快檢呈單靶標(biāo)陽性而常規(guī)試劑檢測為雙靶標(biāo)陽性，這與復(fù)陽個體體內(nèi)存在的不是活病毒，病毒序列不完整，為殘存的核酸片段有關(guān)。復(fù)陽檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)不同的試劑檢出不同的單靶標(biāo)陽性；或同一種試劑重復(fù)測定檢出不同的單靶標(biāo)陽性；或重復(fù)測定部分陽性，部分陰性；以及檢出陽性后，重新采樣檢測為陰性，連續(xù)多日陰性后又檢出陽性等情況。

綜上所述，在臨床檢測過程中，應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)史、不同試劑的檢測結(jié)果、原始擴增曲線以及Ct值進行綜合判斷和結(jié)果分析；對需要重新采樣的樣本應(yīng)嚴(yán)格按照國家文件進行重新采樣復(fù)核[3]；對復(fù)陽人群參照國家最新發(fā)布的第九版《新型冠狀病毒肺炎防控方案》[3]采取相關(guān)處理措施。