楊娜，陳捷，李美娟，葛佳佳，張瀟莉，王敏，朱懷軍，成曉亮，顧林，葛衛(wèi)紅

(1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，南京 210008；2.南京市婦幼保健院婦科內分泌科，南京 210001；3.南京品生醫(yī)療科技有限公司研發(fā)中心技術部，南京 210032)

雌激素是一種類固醇激素，在體內由上游雄激素通過芳香化酶代謝生成并通過細胞色素P450酶[1]、甲基轉移酶[2]、葡萄糖醛酸轉移酶[3]、磺基轉移酶等酶類進一步發(fā)生下游代謝，如圖1。除雌二醇(estradiol，E2)外，多種雌激素代謝物均具有生物學活性，并與相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-5]。

注:E1，雌酮(estrone)；E2，雌二醇(estradiol)；E3，雌三醇(estriol)；16-keto-E2，16-酮雌二醇(16-ketoestradiol)；16Epi，16-表雌三醇(16-epiestriol)；17Epi，17-環(huán)雌三醇(17-epiestriol)；2OHE1，2-羥基雌酮(2-hydroxyestrone)；4OHE1，4-羥基雌酮(4-hydroxyestrone)；16OHE1，16α-羥基雌酮(16α-hydroxyestrone)； 2OHE2，2-羥基雌二醇(2-hydroxyestradiol)；4OHE2，4-羥基雌二醇(4-hydroxyestradiol)；2MeOE1，2-甲氧基雌酮(2-methoxyestrone)；4MeOE1，4-甲氧基雌酮(4-methoxyestrone)；2MeOE2，2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol)； 4MeOE2，4-甲氧基雌二醇(4-methoxyestradiol)；-G/S，各類雌激素葡萄糖醛酸結合/硫酸結合型代謝物。圖1 雌激素代謝網(wǎng)絡

絕經(jīng)期婦女卵巢功能衰退導致雌激素水平顯著下降(可低至1 pg/mL以下)，可進一步影響機體神經(jīng)系統(tǒng)[6]、心血管系統(tǒng)[7]和骨代謝系統(tǒng)[8]進而誘發(fā)絕經(jīng)期綜合癥。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)期雌激素及代謝物的水平與并發(fā)癥的發(fā)生風險密切相關[9]。E2水平低于5 pg/mL的絕經(jīng)后婦女髖部和椎骨骨折風險增加2.5倍[10]。絕經(jīng)后患骨關節(jié)炎婦女血清中2-羥基雌二醇(2-hydroxyestradiol，2OHE2)水平顯著高于無骨關節(jié)炎婦女[11]。同時，血清雌激素2位碳和4位碳羥基化代謝產(chǎn)物、甲基化代謝產(chǎn)物水平與絕經(jīng)后婦女子宮內膜癌發(fā)病風險密切相關[12]。因此，建立可同時檢測雌激素及其代謝物的高靈敏度測定方法對于監(jiān)測絕經(jīng)后婦女體內雌激素整體水平、研究及預判相關并發(fā)癥的發(fā)病風險、尋找并發(fā)癥生物學標志物以及實施激素替代療法后風險與獲益的評估均具有重要意義。

然而現(xiàn)階段免疫測定法最常用于類固醇的檢測，其靈敏度低、特異性差、測定種類少[13]。本研究基于柱前衍生化前處理技術建立了一種高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)，直接檢測雌激素代謝通路中包括羥化、甲基化等13類游離型雌激素代謝物，結合酶解法分別檢測各類雌激素在血清中的總量，間接計算13類葡萄糖醛酸結合/硫酸結合型雌激素代謝物(-glucuronide/sulfate，-G/S)，并在絕經(jīng)后婦女血清樣本中進行驗證。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 Waters UPLC Ⅰ-Class/Xevo TQS超高效液相質譜聯(lián)用儀、Waters BEH C18 columns(美國Waters公司)；DW-HL340超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)；TGL-16.5M冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器公司);CV200真空濃縮儀(北京吉艾姆科技公司)；XMTD-8222恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備公司)。雌酮(estrone，E1，批號：00849-200501)、E2(批號：100182-201205)、雌三醇(estriol，E3，批號：100934-201302)購自中國食品藥品檢定研究院(純度均大于96%)；16-表雌三醇(16-epiestriol，16Epi，純度96%，批號：29-AZC-158-2)、17-環(huán)雌三醇(17-epiestriol，17Epi，純度95%，批號：20-THT-39-2)、2-羥基雌酮(2-hydroxyestrone，2OHE1，純度98%，批號：3-SBT-43-2)、16α-羥基雌酮(16α-hydroxyestrone，16OHE1，純度97%，批號：3-CGF-67-6)、2OHE2(純度96%，批號：6-SBT-57-6)、2-甲氧基雌酮(2-methoxyestrone，2MeOE1，純度98%，批號：2-AKS-176-1)、4-甲氧基雌酮(4-methoxyestrone，4MeOE1，純度97.72%，批號：1-SRE-175-1)、2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2MeOE2，純度98%，批號:1-GNM-86-4)、4-甲氧基雌二醇(4-methoxyestradiol，4MeOE2，純度98%，批號：4-YKZ-7-1)、雌酮-d4(estrone-d4，E1-d4，純度98.4%，批號：2-RVK-138-4)購自加拿大TRC公司；4-羥基雌酮(4-hydroxyestrone，4OHE1，純度90%，批號：MKCG7392)、丹磺酰氯(批號：03641)、L-抗壞血酸(批號：SLBM0850V)、β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶液(來自Helix pomatia，Type HP-2，批號：50783523)購自美國Sigma公司；醋酸鈉、叔丁基甲醚購自阿拉丁公司；甲醇、乙腈(色譜純)購自德國Merck公司。

1.2方法

1.2.1儲備液和工作液配制 分別精密稱取E1、E2、E3、16Epi、17Epi、2OHE1、4OHE1、16OHE1、2OHE2、2MeOE1、4MeOE1、2MeOE2、4MeOE2及內標E1-d4的對照品粉末各2 mg，分別置入20 mL容量瓶中，加入含5 mmol/L L-抗壞血酸的甲醇溶液定容，顛倒搖勻配成各類雌激素及內標終濃度為100 μg/mL的儲備液后，將各類雌激素儲備液混合，制成混合標準曲線工作液。內標儲備液采用含L-抗壞血酸的甲醇溶液逐級稀釋至0.2 ng/mL，-20 ℃儲存。

1.2.2血清樣品處理 200 μL血清樣品置于1.5 mL EP管中，加入20 μL內標工作液，渦旋5 s，加入900 μL叔丁基甲醚，振蕩5 min，然后21 530×g離心5 min；轉移EP管中的上清液750 μL至1.5 mL EP管中，氮氣吹干，加入50 μL硼酸緩沖液(pH 10.0)，再加入丙酮溶解的丹磺酰氯衍生化溶液50 μL(1 mg/mL)。渦旋10 s，然后將樣品放置在65 ℃烘箱中5 min衍生化反應，完成后室溫放置，21 530×g離心3 min，吸取70 μL上清液于進樣小瓶中待進樣。

1.2.3血清β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶水解 配制0.15 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 4.1)，并用該緩沖液配制含4 mg/mL抗壞血酸緩沖液。取2 mL EP管，于200 μL血清樣品中加入198 μL上述含抗壞血酸緩沖液以及2 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶液，充分混勻，振蕩樣品后于37 ℃水浴鍋溫浴20 h。酶解后樣品測定結果為總雌激素，“1.2.2項”未酶解樣品測定結果為游離型雌激素，計算兩者差值可得葡萄糖醛酸結合/硫酸結合型雌激素(-G/S)。

1.2.4色譜條件 對液相條件進行優(yōu)化，結果顯示W(wǎng)aters BEH C18 columns(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱對各類雌激素具有較好的分離效果。流動相A相為含有0.05%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的水溶液，流動相B相為含有0.05%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液，流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序為0.0～4.1 min：78% B相；4.1～4.2 min：78%～81% B相；4.2～5.0 min：81% B相；5.00～5.01 min：81%～78% B相；5.01～7.0 min：78% B相。柱溫為50 ℃，整個運行時間為7 min，進樣體積為10 μL。

1.2.5質譜條件 UPLC Ⅰ-Class/Xevo TQS液質聯(lián)用系統(tǒng)；離子源：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；多重反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓為1 kV；源溫度：150 ℃；霧化氣溫度：400 ℃；霧化氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：150 L/h。分別對13種雌激素及內標的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量進行逐一優(yōu)化和確認，使目標化合物具有最高靈敏度，見表1。

表1 MRM離子參數(shù)

1.3方法性能評價

1.3.1標準曲線和定量下限(LOQ) 參考內源性物質測定方法[14]，配制終濃度為1、2、4、10、20、100、200、500 pg/mL標準曲線，按“1.2.2血清樣品處理”操作后進行質譜定量分析。采用TargetLynx軟件分別以各種雌激素濃度為橫坐標(X)，目標峰面積與內標峰面積比值為縱坐標。最小二乘法進行線性回歸(權重1/X)。選擇最低濃度樣品，同時滿足3個批次且每個批次平行6份樣品，總相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)<20%、準確度<15%且信噪比>10則為本方法的LOQ。

1.3.2精密度 配制低、中、高3個水平血清基質混合質控樣品，每個批次每個濃度平行6個樣品，連續(xù)測定3個批次(3 d)，樣品總數(shù)共54份，按“1.2.2血清樣品處理”操作后進行質譜定量分析，計算每個濃度同一批次內6個樣品(批內)和3個批次(批間)的RSD，若RSD<15%則滿足測定要求。

1.3.3加標提取回收率 參考臨床檢測方法的開發(fā)與驗證[15]，選取一份已知濃度的血清基質樣品作為原始樣品，分別向該樣品中加入低、中、高濃度的混合雌激素對照品溶液，制備3個濃度的加標樣品，原始樣品及每個濃度加標樣品平行6份，每份重復測定3次，按“1.2.2血清樣品處理”后進行質譜定量分析，計算各個濃度下的加標回收率，若加標回收率在±15%內，則本方法正確度符合要求。

1.3.4穩(wěn)定性 配制低、中、高3個水平的血清基質混合質控樣品，按“1.2.2血清樣品處理”操作，分別考察血清樣品處理前在室溫放置2、4、6 h的穩(wěn)定性，血清樣品處理前在4 ℃冰箱放置24、36、48 h的穩(wěn)定性，血清樣品處理前反復凍融3次(-80 ℃→25 ℃)穩(wěn)定性，血清樣品處理后進樣盤放置12、24 h穩(wěn)定性，其中每個濃度平行3個樣品，分別計算每個濃度樣品在上述相應處置方式下的穩(wěn)定性。

1.4絕經(jīng)后婦女血清樣品分析 收集2021年于南京市鼓樓醫(yī)院和南京市婦幼保健院體檢的絕經(jīng)后婦女血清樣品29份，每份1 mL。納入標準：(1)年齡為55～65周歲；(2)絕經(jīng)1年以上；(3)近3個月未使用激素類藥品；(4)子宮、卵巢與乳腺無惡性疾病；(5)心肝腎功能檢查均正常。排除標準：(1)有精神類疾??；(2)糖尿病、甲狀腺功能亢進、心腦血管疾病患者。將收集的血清樣品按“1.2.2血清樣品處理”操作進行質譜定量分析。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行。絕經(jīng)后婦女血清樣品結果采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)性數(shù)據(jù)用M(P25，P75)表示。

2 結果

2.1雌激素及代謝物的代表色譜圖 各類激素的峰形保留時間見圖2，分別為3.95 min(E1)、4.38 min(E2)、2.28 min(E3)、2.83 min(16Epi)、3.01 min(17Epi)、5.72 min(2OHE1)、6.05 min(4OHE1)、2.34 min(16OHE1)、6.15 min(2OHE2)、3.50 min(2MeOE1)、3.84 min(4MeOE1)、3.94 min(2MeOE2)、4.08 min(4MeOE2)。各類雌激素峰形良好。其中，2MeOE2與4MeOE2是同分異構體，結構特性接近，在多種型號規(guī)格的色譜柱上分離度相對較弱，本法采用的液相色譜條件為現(xiàn)階段摸索最優(yōu)色譜條件，重疊峰的交點位于小峰的半峰高之下，定量產(chǎn)生的誤差相對較小，相關方法性能評價結果滿足定量要求。此外，其他各類同分異構體在此條件下均有相對較好的分離，且相互未產(chǎn)生干擾。經(jīng)驗證各類雌激素在該方法下特異性良好。

注：A、B為E1、E2色譜圖，C為E3、16Epi、17Epi色譜圖，D為2OHE1、4OHE1色譜圖，E、F為16OHE1、2OHE2色譜圖，G為2MeOE1、4MeOE1色譜圖，H為2MeOE2、4MeOE2色譜圖。圖2 LC-MS/MS測定13種雌激素色譜圖

2.2標準曲線和定量下限 E1、E2、16Epi、4OHE1、16OHE1、2MeOE1、4MeOE1、4MeOE2的定量下限為1 pg/mL，E3、17Epi、2OHE1、2OHE2、2MeOE2的定量下限為2 pg/mL。在線性范圍內，13種雌激素線性關系良好，且相關系數(shù)(r)均大于0.99，定量下限6次平行樣本測定RSD均<20%。

2.3精密度 本方法下測定的各類雌激素批內和批間精密度RSD均在15%以內(表2)，滿足生物樣本測定相關要求。

表2 各類雌激素批內/批間精密度

2.4加標提取回收率 各雌激素平均回收率均在90.3%～111.3%之間，見表3，說明該方法準確性較高。

表3 各類雌激素加標提取回收率

2.5穩(wěn)定性 含各類雌激素低、中、高濃度的血清樣品衍生化處理前在室溫放置2、4、6 h，或血清樣品處理前在4 ℃冰箱放置24、36、48 h以及血清樣品處理前反復凍融3次(-80 ℃→25 ℃)均穩(wěn)定，RSD不超過±15%。血清樣品處理后進樣盤放置12、24 h均穩(wěn)定，RSD均不超過±15%。

2.6絕經(jīng)后婦女血清樣品分析 見表4。結果顯示，絕經(jīng)后婦女血清中E2處于較低水平，E1-G/S中位濃度為158.7 pg/mL，在所有雌激素中水平最高，且為游離型的14倍。16OHE1-G/S中位水平僅次于E1-G/S。2-羥化和16-羥化代謝通路占較高代謝比例，遠高于4-羥化代謝通路，16-位羥化和2-位羥化代謝通路代謝物總和中位濃度分別是4-位羥化代謝通路的27.5倍和19.5倍。各類雌激素葡萄糖醛酸/硫酸結合型水平均不低于其游離型水平，16Epi、17Epi、2OHE1、16OHE1、2OHE2和4MeOE1的游離型在所有樣品中均未檢出，提示雌激素在體內較易形成活性較低的Ⅱ相代謝物。各類雌激素代謝物水平個體差異明顯，其中2OHE1-G/S顯示出最為顯著的個體差異。雖然，絕經(jīng)后婦女臨床重要雌激素指標E2處于較低水平，但本法測定的結果顯示血清雌激素總量遠高于E2，中位水平為E2的149.4倍。

表4 絕經(jīng)后婦女血清各類雌激素水平分析[M(P25，P75)，n=29]

3 討論

由于缺乏對照品，本方法采用酶解法同時對雌激素葡萄糖醛酸結合和硫酸結合型代謝物的水平進行間接測定，完成雌激素及下游Ⅰ相、Ⅱ相代謝物水平的整體描繪。

本法中2MeOE2與4MeOE2由于是同分異構體，結構特性非常接近，分離較為困難，在實驗過程中使用Waters C18、Waters T3、Agilent C18等多種型號色譜柱均未實現(xiàn)完全基線分離。后續(xù)研究還需進一步尋找更優(yōu)分離條件。本法采用丹磺酰氯衍生化技術，極大地提高了雌激素檢測的靈敏度，因此本法的線性范圍適用于絕經(jīng)后女性體內低水平雌激素的測定。絕經(jīng)前女性雌激素水平較高，且由于月經(jīng)周期的變化，不同時期水平變化較大[16]，實際檢測中存在一定數(shù)量患者超出線性范圍的情況，故未做對比研究。

本研究中，雖然前體雌激素E1游離型及結合型水平均高于E2，但其與雌激素受體(ERα和ERβ)親和活性顯著低于E2，因此其雌激素樣生物學活性低于E2。研究表明，雌激素代謝物具有一定程度的生理活性或致病性，如2-OHE2可以減弱肥胖的發(fā)展，改善腎功能并以獨立于雌激素受體的方式抑制子宮內膜細胞的增殖[17]；2OHE1/16OHE1比值與乳腺癌風險呈負相關等[18]。雖然絕經(jīng)后婦女體內雌激素整體水平降低，但諸多研究已證實絕經(jīng)后相關并發(fā)癥的發(fā)生與體內雌激素代謝物的水平具有密切關聯(lián)。本法測定的結果顯示血清雌激素總量遠高于臨床常規(guī)指標E2，提示絕經(jīng)后女性體內仍還有一定水平的雌激素代謝通量，對絕經(jīng)后活性雌激素代謝物水平的研究具有重要意義。本研究結果還顯示，絕經(jīng)后婦女血清雌激素代謝物存在較大個體差異，其原因不僅與E2等上游雌激素水平相關，還與下游代謝酶在脂肪等性腺外組織中表達水平差異性相關[19]，因此，諸多疾病本身也會造成雌激素代謝物水平的變化。綜上，本方法具有較高靈敏度，可同時檢測多種雌激素及代謝物，為監(jiān)測絕經(jīng)后婦女體內雌激素整體及局部水平、確定參考值區(qū)間、研究相關并發(fā)癥的發(fā)病風險因子以及實施激素替代療法后風險與獲益的評估提供技術支撐，但尚需擴大樣本量以進一步研究。