蔡麗瓊，陳瑞，楊德強，趙長林*

(1.西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224；2.云南國誠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，云南 昭通 657000)

天麻(Gastrodia elataBl.)又名赤箭、定風草、獨搖芝等，蘭科多年生草本植物，為優(yōu)質(zhì)道地藥材[1－3]。20世紀50年代，天麻人工栽培技術(shù)被攻破，在全國范圍內(nèi)廣泛推廣并促進了天麻種植業(yè)的發(fā)展，但天麻連續(xù)多代種植后，會出現(xiàn)病害加重、產(chǎn)量降低和天麻品質(zhì)變劣等問題[4]。連作障礙普遍存在于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，相較于其他作物，藥用植物因其特殊化學物質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物，在生產(chǎn)過程中更易發(fā)生連作障礙[5－6]。

微生物是土壤中除植物和動物外的另一種能量載體[7－8]，在土壤功能和植物健康等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[9－10]，其群落結(jié)構(gòu)在很大程度上決定著土壤的生物活性[11]。研究[12－14]揭示，隨著種植年限的增加，多種藥用植物根際土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化，如西洋參、三七、丹參等。劉偉等[14]研究揭示，丹參重茬種植后，其根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，連作致使土壤中耐冷酵母屬真菌豐度顯著降低，異常威克漢姆酵母屬真菌豐度顯著上升，且連作兩年土壤中炭疽菌屬真菌等致病菌成為優(yōu)勢菌屬，進而導致丹參發(fā)病率提升；高嵩等[15]基于龍膽草根際土壤細菌多樣性研究表明:隨連作年限增加，龍膽草根際土壤細菌多樣性逐年降低，而病原微生物豐度增加，進而導致根際微生態(tài)失衡，造成龍膽草連作障礙；周界等[16]基于高通量測序技術(shù)分析穿心蓮連作根際土壤細菌群落多樣性發(fā)現(xiàn)連作種植降低了土壤細菌的豐富度和多樣性，使土壤微生態(tài)平衡遭到破壞，同時有益菌相對豐度降低，病原菌相對豐度增加，進而造成細菌群落結(jié)構(gòu)改變和失衡。

開展天麻及其根際土壤微生物研究，不僅有助于分析天麻與根際土壤微生物之間的相互作用機制，而且也有助于解決天麻病害防治及連作障礙等實際生產(chǎn)應用問題，提高天麻產(chǎn)量和品質(zhì)。目前關(guān)于云南省昭通地區(qū)天麻與根際土壤微生物相互作用的研究報道較少，天麻在生長過程中與根際微生物相互作用的機制也不明確，因此，本研究通過高通量測序技術(shù)研究不同種植茬數(shù)天麻根際土壤真菌群落，分析其組成、豐度和多樣性，旨在找到連作土壤中優(yōu)勢真菌類群，進而從微生物生態(tài)學角度研究天麻連作障礙的成因，為天麻連作障礙防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣地條件

本研究對象分布于云南省昭通市彝良縣喬山鎮(zhèn)海壩村 (海拔 1650 m，27°39′33″N，104°16′14″E)，年均氣溫11℃，年均降水量860 mm，屬亞熱帶季風氣候。

1.2 土壤樣品采集

試驗共設3個處理，所有處理均在同一塊地上進行，土壤類型相同，每組試驗相鄰種植，間距30 cm，每個處理平行取樣3份，共9個土樣?？瞻捉M為未種植天麻的土壤(cha001:CLZ019、CLZ020、CLZ021)、新茬天麻土壤(cha002:CLZ0015、CLZ016、CLZ017)、重茬天麻土壤(cha003:CLZ079、CLZ080、CLZ081)。新茬天麻于2019年12月種下，2020年9月份收集天麻根際土壤樣本；重茬天麻于2020年在新茬天麻土壤樣地連續(xù)種下天麻，2021年9月收集重茬天麻根際土壤樣本。根際土壤采用五點取樣法，用鐵鏟除去覆蓋天麻表面的土壤、植物根系、碎石及其他雜物，挖至天麻的塊根部位，用滅菌的刷子和不銹鋼鏟收集附著于根系0～5 mm范圍內(nèi)的土壤，裝入已滅菌的離心管(50 mL)，注明樣品編號、名稱、地點、日期及采集者，置于－80℃冰箱保存，用于提取土壤真菌DNA。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤總DNA的提取與電泳檢測

分別取3個處理的土壤樣品，使用E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio－tek，Norcross，GA，U.S.)土壤DNA試劑盒，按照說明書進行微生物群落總DNA的提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，DNA濃度和純度用NanoDrop 2000紫外可見分光光度計測定。

1.3.2 土壤真菌ITS序列的PCR擴增及高通量測序

將提取的總DNA作為模板，采用真菌通用引物ITS1－ITS2(ITS1F:5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′，ITS2R:5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′)擴增。擴增程序為95 ℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃終止延伸10 min結(jié)束。每個樣品重復3次，混合同一樣品的PCR產(chǎn)物，后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extractin Kit凝膠回收試劑盒進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，采用QuantiFluorTM－ST對回收產(chǎn)物進行檢測、定量。Miseq文庫構(gòu)建和測序均在北京諾禾致源科技股份有限公司進行，測序平臺為Illumina Novaseq 6000。

1.3.3 生物信息學分析

對Illumina Miseq測序所得數(shù)據(jù)進行處理，得到優(yōu)質(zhì)序列進行下列分析。使用QIIME2軟件對所得優(yōu)質(zhì)序列進行聚類，以97%的相似性將序列聚類為OTUs，挑選豐度最大的序列作為代表進行分類注釋及分類學分析，使用R語言進行稀釋曲線構(gòu)建[17]。利用QIIME軟件進行多樣性分析，計算各物種多樣性指數(shù)，用來衡量不同種植年限天麻根際土壤真菌多樣性。利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。使用QIIME軟件進行Beta多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面的相似程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

基于稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)的合理性，間接反映樣品中物種的豐富程度。當曲線趨于平緩時，說明測序數(shù)據(jù)量滿足試驗要求[18]。本研究測序數(shù)據(jù)的稀釋曲線(圖1)表明:OTU數(shù)目隨著測序數(shù)量的增加而增加，曲線呈先上升后趨于平緩的趨勢，當達到足夠的數(shù)量之后，真菌曲線均進入飽和狀態(tài)，即測序量足以覆蓋土壤樣品的真菌類群。本研究測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度能夠覆蓋樣品根際土壤中的全部真菌微生物。

圖1 天麻根際土壤樣品真菌的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of fungi in rhizosphere soil sample of Gastrodia elata

2.2 真菌群落豐富度多樣性統(tǒng)計分析

本研究通過Illumina測序平臺深入分析9個土壤樣品，獲得1 957 704條eads，每個樣品至少產(chǎn)生30 891條Clean Reads，平均產(chǎn)生186 984條Clean Reads。在97%序列相似性基礎上可劃分為1342個OTUs，3組樣品所含真菌OTU數(shù)量分別為723、675、210個，種植不同茬數(shù)天麻的根際土壤OTU數(shù)量排序為cha001(未種植)＞cha002(新茬)＞cha003(重茬)。Alpha多樣性分析結(jié)果(表1)表明，不同種植茬數(shù)天麻根際土壤真菌群落豐富度指數(shù) (Ace指數(shù)、Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))存在如下規(guī)律:cha002＞cha001＞cha003，即3個處理樣品變化趨勢均呈現(xiàn)先升高后下降趨勢。樣品cha002的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，揭示該樣品中根際土壤微生物豐富度較高；樣品cha002的Shannon均勻度指數(shù)最大，表明該樣品中微生物群落分布的均勻度較高；3組樣品覆蓋度均為1.0，進一步闡釋測序結(jié)果能夠代表蕎山鎮(zhèn)天麻根際土壤微生物的真實情況。結(jié)果表明:新茬天麻土壤中的真菌多樣性比未種植天麻的根際土壤豐富，而重茬天麻土壤中的真菌多樣性顯著低于未種植和新茬天麻土壤的，其暗示隨著種植茬數(shù)增加，豐富度及多樣性指數(shù)呈明顯下降趨勢，揭示了連續(xù)種植天麻明顯降低了土壤真菌多樣性，連作使土壤真菌群落的種類趨于單一化，且種類數(shù)量降低。

表1 天麻根際土壤樣品真菌Alpha多樣性Table 1 Fungi Alpha diversity of rhizosphere soil samples of Gastrodia elata

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 在門水平上的土壤真菌群落豐富度分析

基于天麻不同種植茬數(shù)根際土壤的真菌群落在門水平進行分析，圖2表明，其主要為Ascomycota、Basidiomycota、unclassified＿Fungi、Mortierellomycota、Glomeromycota、Chytridiomycota、Rozellomycota、Mucoromycota、Kickxellomycota 9 個門。其中，Ascomycota、Basidiomycota、unclassified＿Fungi和Mortierellomycota為突出優(yōu)勢菌門，Ascomycota為未種植天麻(cha001)和新茬天麻 (cha002)根際土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌門，相對豐度分別為56.20%和63.58%，隨種植茬數(shù)增加相對豐度呈先升高后降低趨勢；Basidiomycota為重茬天麻根際土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌門，相對豐度達42.83%，其豐度隨種植茬數(shù)增加呈上升趨勢；unclassified＿Fungi在未種植天麻土壤中所占比例較高，達21.98%，豐度隨連作茬數(shù)增加而降低；Mortierellomycota的豐度隨連作茬數(shù)增加呈先升高后降低趨勢。

圖2 不同根際土壤樣品真菌在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at phylum level

2.3.2 在綱水平上的土壤真菌群落豐度分析

通過對不同種植茬數(shù)天麻根際土壤綱水平的分析(圖3)，揭示其真菌群落分為27個類群，由高到低依次為 Agaricomycetes、Archaeorhizomycetes、unclassified＿Ascomycota、unclassified＿Fungi。其中，unclassified＿Ascomycota為未種植天麻土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌綱，相對豐度達34%，該菌群豐度隨天麻連作茬數(shù)的增加顯著降低，其次為unclassified＿Fungi，相對豐度達21.98%，相對豐度隨種植茬數(shù)增加呈降低趨勢；Archaeorhizomycetes為新茬天麻根際土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌綱，相對豐度達25.45%，連作提高了Archaeorhizomycetes的豐度，并隨種植茬數(shù)的增加呈降低趨勢；而Agaricomycetes為重茬天麻根際土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌綱，相對豐度達38.77%，該菌綱相對豐度隨種植茬數(shù)的增加呈顯著上升趨勢。

圖3 不同根際土壤樣品真菌在綱水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at class level

2.3.3 在目水平上的土壤真菌群落豐度分析

基于不同種植茬數(shù)天麻根際土壤真菌群落在目水平上(圖4)研究揭示:其分為59個類群，優(yōu)勢菌目由高到低依次為 Archaeorhizomycetales、unclassified＿Ascomycota、unclassifed＿Fungi、Mortierellales。其中unclassified＿Ascomycota和unclassifed＿Fungi在未種植天麻土壤中占比最高，相對豐度分別達34%、21.98%，并隨種植茬數(shù)增加呈降低趨勢；Archaeorhizomycetales在新茬天麻和重茬天麻土壤中相對豐度最高，達25.45%、15.49%，可以看出，連作顯著提高了Archaeorhizomycetales的相對豐度，隨種植茬數(shù)增加其豐度逐漸降低；連作天麻土壤中的Mortierellales豐度高于未種植天麻土壤中的相對豐度，且隨種植茬數(shù)增加豐度逐漸降低。重茬天麻土壤中Helotiales和Polyporales相對豐度顯著升高，該目在未種植和新茬天麻土壤中相對豐度極低，Polyporales在新茬天麻土壤中相對豐度為0，由此可見，天麻連作在目水平上改變了土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖4 不同根際土壤樣品真菌在目水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at order level

2.3.4 在屬水平上的土壤真菌群落豐度分析

對不同種植茬數(shù)天麻根際土壤真菌群落屬水平上 (圖5)分析表明:共分為165個類群，優(yōu)勢菌屬由高到低依次為Archaeorhizomyces、unclassified＿Ascomycota、unclassified＿Fungi、unidentified 和Mortierella。其中unclassified＿Ascomycota和unclassified＿Fungi為未種植天麻土壤中相對豐度最高的兩個類群，相對豐度為34%、21.98%，且豐度隨種植茬數(shù)的增加呈顯著降低趨勢；Archaeorhizomyces為新茬和重茬天麻根際土壤真菌群落的第一優(yōu)勢菌屬，相對豐度達25.45%、15.49%，連作土壤中該類群豐度高于未種植天麻的土壤，隨種植茬數(shù)增加呈降低趨勢；連作還提高了土壤中Mortierella的豐度，且在重茬天麻根際土壤中出現(xiàn)新類群Sebacina和Paxillus。

圖5 不同根際土壤樣品真菌在屬水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance of fungi in different rhizosphere soil samples at genus level

2.4 不同年限土壤真菌菌群的分類學組成分析

采用R軟件對不同種植茬數(shù)天麻根際真菌在門水平上的群落組成數(shù)據(jù)根據(jù)分類單元的豐度加以聚類，并通過熱圖呈現(xiàn)其分析結(jié)果(圖6)，通過聚類可以將高豐度和低豐度的分類單元區(qū)分，并以顏色梯度反映樣品之間的群落組成相似度[12]。結(jié)果表明:橫向真菌群落根據(jù)進化關(guān)系聚類為兩大支，其中cha003組單獨聚為一類，再與cha001和cha002組聚為另一類，這表明cha001和cha002組在群落結(jié)構(gòu)分布上相近，與cha003組的真菌菌群結(jié)構(gòu)分布有明顯差異?？v向OTU間聚為兩大支，根據(jù)變化趨勢的類型基本上可以分為4類，類群(Ⅰ)在cha001組中所占比例較低，在cha003組中所占比例最高；類群(Ⅱ)在cha003組中所占比例較低，在cha001組中所占比例較cha002組高；類群(Ⅲ)在cha001組中所占比例較高，在cha002組和cha003組中所占比例均顯著降低；類群(Ⅳ)在cha002組中所占比例較高，在cha003組中所占比例顯著降低。

圖6 不同根際土壤樣品真菌在門水平上的聚類熱圖Fig.6 Cluster heatmap of fungi in different rhizosphere soil samples at phylum level

2.5 Beta多樣性分析

采用β－多樣性分析深入探究不同樣本之間群落結(jié)構(gòu)的相似性，主坐標分析[19](Principal coordinates analysis，PCoA)結(jié)果表明(圖7):PC1的貢獻率為46.72%，PC2的貢獻率為17.55%，兩者共解釋了方差變量的64.27%。cha001、cha002和cha003相互之間的距離較遠，說明不同種植茬數(shù)天麻根際真菌群落結(jié)構(gòu)均具明顯差異；cha002和cha003組表現(xiàn)出明顯的組內(nèi)聚集，表明這兩組土壤樣品具有極相似的真菌群落結(jié)構(gòu)。UPGMA分析結(jié)果顯示，樣品越靠近，枝長越短，說明兩個樣品的物種組成越相似，如圖8所示，不同種植茬數(shù)天麻根際真菌群落差異與PCoA分析結(jié)果一致。

圖7 不同根際土壤樣品真菌群落的PCoA分析Fig.7 PCoA analysis of fungal communities in different rhizosphere soil samples

圖8 不同根際土壤樣品真菌群落的UPGMA分析Fig.8 UPGMA analysis of fungal communities in different rhizosphere soil samples

3 討論與結(jié)論

土壤養(yǎng)分和微生物群落對作物的生長發(fā)育有著重要的影響[20]。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，微生物多樣性受多種因素影響，如氣候條件、地理地勢、植物物種、植物輪作、間作與連作等，其中，連作對微生物有顯著影響[21]。土壤中有益微生物減少和病原微生物富集可引發(fā)作物各種土傳病害，導致土壤微生物群落組成多樣性失衡，這是造成連作障礙的根本原因[22]。本研究采用高通量測序技術(shù)開展了未種植天麻與連作天麻根際土壤真菌多樣性及群落組成深入分析，結(jié)果表明:未種植天麻土壤中的OTU數(shù)量多于連作天麻根際土壤，新茬天麻根際土壤樣本的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)數(shù)值高于未種植天麻土壤樣本，但無顯著差異，重茬天麻根際土壤樣本的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)數(shù)值顯著降低，其揭示新茬天麻在一定程度上提高了土壤真菌群落的多樣性，但重茬種植會導致土壤中真菌多樣性降低。整體門水平剖析表明，天麻連作并未改變根際土壤真菌在門水平的種類組成，改變趨向于門下水平組成，其導致不同真菌類群比例在不同種植茬數(shù)中呈現(xiàn)出明顯差異。門水平明晰連作天麻與未種植天麻根際土壤真菌界內(nèi)Ascomycota為優(yōu)勢菌，這與前人相關(guān)研究結(jié)果一致[23－26]，Ascomycota內(nèi)部分腐生菌對土壤中不易降解的有機物有分解作用，可驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)[27－28]，且自然界中多數(shù)Ascomycota具有很強的無性繁殖能力，可以產(chǎn)生大量分生孢子，其快速增長，在數(shù)量上占據(jù)明顯優(yōu)勢[29]，也是Ascomycota在眾多植物根際中所占比例最大的原因。本研究中Ascomycota類群真菌在綱、目、屬水平上unclassified真菌占比較高，且隨連作茬數(shù)增加，豐度顯著降低，但該類群真菌是否對天麻生長發(fā)育有直接影響，以及與天麻連作障礙的成因是否有關(guān)聯(lián)還需進行深入研究。門水平上聚類熱圖結(jié)果表明，Basidiomycota、Chytridiomycota及Rozellomycota的豐度均在重茬天麻土壤中顯著增加，而Ascomycota、Glomeromycota、Mucoromycota、Mortierellomycota及Kickxellomycota的豐度在重茬天麻土壤中均顯著降低。本研究分析發(fā)現(xiàn)，unclassified＿fungi在土壤真菌類群中占比較高，且隨天麻連作茬數(shù)的增加，其豐度顯著降低，其暗示天麻根際與非根際土壤中存在大量未知真菌類群或NCBI未報道類群，且其土壤生態(tài)學功能和與天麻生長發(fā)育之間互動關(guān)系有待進一步研究。

本研究基于屬水平分析揭示各處理的真菌優(yōu)勢菌屬存在較大差異，cha001處理優(yōu)勢菌屬為unclassified＿Ascomycota，cha002 和 cha003 的優(yōu)勢菌屬為Archaeorhizomyces。unclassified＿Ascomycota與unclassified＿Fungi隨連作茬數(shù)增加豐度顯著降低。Archaeorhizomyces是常見的陸生好氣真菌[30]，該屬一些種能利用葡萄糖或纖維素作為其唯一碳源，其暗示可能參與分解，且不需要通過共生從植物獲得碳源，但其生態(tài)作用尚不清楚，前人研究[31]揭示該屬真菌既不是病原菌，也不是外生菌根共生體。Mortierella真菌在不同種植茬數(shù)天麻土壤中占據(jù)一定比例，這與趙文靜等[32－33]研究土壤真菌的多樣性及莖瘤芥根腫病不同發(fā)病時期根際土壤真菌群落變化特征結(jié)果一致。Mortierella真菌是土壤中較為常見的真菌，且對土壤生態(tài)和作物健康有益，并能促進植物根系吸收礦質(zhì)元素、抑制病原菌等[34－35]?；陂T、綱、目、屬水平上分析，連作天麻根際土壤中Mortierella豐度均呈現(xiàn)升高趨勢，但隨連作種植茬數(shù)增加其豐度逐漸降低，因此，其暗示Mortierella在天麻連作過程中扮演一種益生菌的角色，重茬土壤中其豐度顯著降低，可能導致土壤中部分病原菌數(shù)量的增加，也是導致天麻連作障礙形成的因素之一。重茬天麻根際土壤中Sebacina和Paxillus真菌類群呈現(xiàn)由無到有的趨勢，其在未種植天麻和新茬天麻根際土壤中未曾檢查到，其揭示天麻連作直接對屬水平土壤真菌組成結(jié)構(gòu)造成影響。

本研究利用高通量測序技術(shù)分析未種植天麻與連作天麻根際土壤中微生物多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)差異性，結(jié)果揭示連作種植改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成，導致土壤中部分真菌數(shù)量下降，致使土壤微生態(tài)平衡遭到破壞，進而不利于天麻的健康生長，最終導致連續(xù)單一種植天麻出現(xiàn)嚴重連作障礙。