尹彥雨，邢雨桐，吳天凡，王李妍，趙子胥，胡天然，陳源，陳媛，陳德華，張祥

晝夜變溫下高溫與干旱脅迫對棉毒蛋白含量的影響及其生理機制

尹彥雨，邢雨桐，吳天凡，王李妍，趙子胥，胡天然，陳源，陳媛，陳德華，張祥

揚州大學/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點，江蘇揚州 225009

【目的】明確棉葉片Cry1Ac毒蛋白含量對晝夜變溫下高溫干旱脅迫響應(yīng)及其生理機制，為生產(chǎn)中棉抗蟲性的安全穩(wěn)定利用提供參考。【方法】2019—2020年在揚州大學農(nóng)學院，以常規(guī)種泗抗1號（SK-1）和雜交種泗抗3號（SK-3）為材料，以溫度和土壤水分含量為因子，溫度分別設(shè)為34℃（白天，7：00—19：00）/28℃（夜間，19：00—7：00）（A1）、38℃/28℃（A2）；土壤水分含量分別為田間土壤最大持水量的50%（B1）和60%（B2），并以32℃/28℃、田間土壤最大持水量的75%為對照（CK）。各處理分別持續(xù)4、7、10 d（DAS）?！窘Y(jié)果】不同處理導致葉片中Cry1Ac毒蛋白含量降低，且隨著脅迫時間的延長，下降幅度增加。處理間相比，A1B2處理下降幅度最少，7 DAS后開始顯著低于CK；A1B1處理下降幅度其次，4 DAS后顯著低于CK；A2B1、A2B2處理在4 DAS顯著下降?？扇苄缘鞍祝⊿P）含量、硝酸還原酶（NR）、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、游離氨基酸（aa）和谷氨酸合成酶（GOGAT）等活性變化趨勢與毒蛋白一致，且呈極顯著正相關(guān)，而基因表達量、單寧含量、蛋白酶、肽酶活性則呈上升趨勢。逐步回歸和通徑分析篩選出NR、GPT、GS等3個關(guān)鍵指標可反映棉Cry1Ac毒蛋白含量高低，且三者對Cry1Ac毒蛋白含量有較大的正效應(yīng)。【結(jié)論】晝夜變溫下高溫和干旱互作導致棉Cry1Ac毒蛋白含量降低，且隨持續(xù)期延長下降幅度逐漸增大。其中34℃/28℃和田間土壤最大持水量60%脅迫7—10 d內(nèi)與對照無顯著差異。但與晝夜持續(xù)高溫相比，晝夜變溫的高溫脅迫下Cry1Ac毒蛋白含量下降幅度減小和時期明顯推遲。NR、GPT、GS是決定Cry1Ac毒蛋白含量高低的關(guān)鍵指標。

棉；Cry1Ac毒蛋白；高溫；干旱；生理機制

0 引言

【研究意義】自1997年轉(zhuǎn)（）基因抗蟲棉（棉）在中國商品化種植以來，其種植面積逐漸擴大，目前已占總植棉面積的80%以上。因其自身合成一種對棉鈴蟲等鱗翅目類害蟲具有顯著活性的Cry1Ac毒蛋白，可減少農(nóng)藥的使用，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟和生態(tài)效益。但生產(chǎn)中常出現(xiàn)棉Cry1Ac毒蛋白含量和抗蟲性下降，甚至不抗蟲現(xiàn)象。這嚴重影響了它的應(yīng)用效果?！厩叭搜芯窟M展】前人已明確逆境對棉Cry1Ac毒蛋白含量有明顯影響。如夏蘭芹等[1]、Chen等[2]研究表明高溫可致棉Cry1Ac毒蛋白含量急劇降低。Benedict等[3]則發(fā)現(xiàn)6、7月份降水量較少時土壤含水量較低，土壤水分壓力會降低植株中總可溶性蛋白和Cry1Ac毒蛋白的含量。Martins等[4]也發(fā)現(xiàn)長時間的中度水分虧缺會導致Cry1Ac毒蛋白含量下降?；プ饔绊懛矫妫瑥埾榈萚5]發(fā)現(xiàn)溫度和土壤水分通過調(diào)控蛋白質(zhì)分解和合成，共同影響棉Cry1Ac毒蛋白表達。逆境影響轉(zhuǎn)基因作物毒蛋白含量的機制有以下幾種推斷，一種推斷認為在逆境下，基因35S啟動子甲基化失活，使得基因表達關(guān)閉，從而使得植株最終殺蟲蛋白含量降低[6]。Allah等[7]則通過使用新的啟動子實現(xiàn)殺蟲蛋白在棉花整個生育期的持續(xù)表達，進一步驗證了這一觀點；第二種推斷認為不良環(huán)境下植株體內(nèi)產(chǎn)生某些次生代謝物質(zhì)（如單寧），與毒蛋白結(jié)合導致其活性喪失[8]；第三種推斷認為在逆境下，蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶（硝酸還原酶、丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶）活性下降、蛋白質(zhì)分解相關(guān)酶（蛋白酶、肽酶）活性增加，導致Cry1Ac毒蛋白含量下降[9]。【本研究切入點】前人研究設(shè)置的高溫處理主要是晝夜恒定高溫，而實際生產(chǎn)中，一天中溫度是呈晝夜周期性（晝高夜低）變化的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過人工模擬生產(chǎn)上可能出現(xiàn)的晝夜變溫下高溫與干旱互作逆境，探討棉Cry1Ac毒蛋白含量對該逆境的響應(yīng)及其生理機制，從而為棉抗蟲性安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設(shè)計

試驗于2019—2020年在揚州大學農(nóng)學院試驗溫室（32°24′42″ N，119° 41′29″ E）進行。2019年以生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉常規(guī)品種泗抗1號（SK-1），2020年以SK-1和雜交品種泗抗3號（SK-3）為材料。品種由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所提供，具有相似遺傳背景，且SK-1耐高溫能力較弱，SK-3耐高溫能力強[10]。采用盆栽試驗，所用盆缽直徑40 cm，高50 cm，每盆裝20 kg過篩砂壤土（含有機質(zhì)18.8 g·kg-1、水解氮134.7 mg·kg-1、速效磷22.5 mg·kg-1和速效鉀81.3 mg·kg-1）。采用育苗移栽方式，兩年均于4月6日播種，出苗41 d后，選擇長勢一致的壯苗移栽至盆缽中，每盆1株。其他生長管理措施按大田高產(chǎn)栽培要求進行。依據(jù)前期研究結(jié)果[10]，溫度設(shè)2個處理，白天（7：00—19：00）分別為34℃（A1）、38℃（A2），夜間（19：00—7：00）均為28℃；土壤水分含量設(shè)2個處理，分別為田間土壤最大持水量的50%（B1）和60%（B2），并以溫度32℃（白天）/28℃（夜間）、田間土壤最大持水量的75%為對照（CK）。每個處理種植10盆，3次重復。于7月20日開始控制澆水，7月30日當土壤含水量達到預設(shè)值時開始處理，應(yīng)用人工氣候室控制溫度（精度：±0.5℃），光照30 000 lux（采用飛利浦T5燈和美國GE農(nóng)用鈉燈控制光源）；于每日6：00、14：00、22：00使用WET土壤三參數(shù)速測儀監(jiān)測土壤水分，當發(fā)現(xiàn)土壤水分低于設(shè)計值時采用稱重法控制土壤水分定量補水。脅迫4、7、10 d后（days after stress，DAS），取棉株相同部位果枝葉，液氮冷凍后進行相關(guān)指標測定。

1.2 測定項目

1.2.1 Cry1Ac毒蛋白含量 采用酶聯(lián)免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）測定[11]，藥盒由中國農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2.2基因表達量（gene expression level，ELBG） 采用ZHANG等[12]方法測定，試劑盒為OmniPlant RNA Kit，由康為世紀公司提供。

1.2.3 可溶性蛋白（SP）含量 應(yīng)用G-250考馬斯亮藍比色法測定[13]。

1.2.4 游離氨基酸（aa）含量 應(yīng)用抗壞血酸茚三酮染色法測定[14]。

1.2.5 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性 鮮樣經(jīng)Tris-HCL緩沖液研磨離心后，用提取液測定谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性[13]。

1.2.6 谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）活性 鮮樣加Tris-HCl緩沖液后，研磨離心。測定提取液中GS和GOGAT活性，方法見參考文獻[15-16]。

1.2.7 硝酸還原酶（NR）活性 用李文才等[17]方法測定。

1.2.8 蛋白酶活性、肽酶活性的測定 分別運用考馬斯亮藍法、茚三酮和抗壞血酸比色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量，進而計算蛋白酶和肽酶活性[18]。

1.2.9 單寧含量 用楊宇暉等[19]方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

運用Excel 2010、SPSS16.0等軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，采用兩因素隨機區(qū)組和Duncan法進行方差分析和多重比較（＜0.05）。利用R語言制圖。

2 結(jié)果

2.1 高溫與干旱脅迫對Bt棉葉片Cry1Ac毒蛋白含量影響

表1表明，晝夜變溫下高溫干旱脅迫導致棉葉片Cry1Ac毒蛋白含量下降。處理間相比，A1B2處理下降幅度最低，7DAS（2020年）才顯著低于CK；A1B1下降幅度其次，在4DAS（2020年）才開始顯著低于CK；A2B1、A2B2處理則在4DAS便顯著下降。品種間相比，常規(guī)種SK-1葉片中蛋白含量下降幅度比雜交種SK-3更大。

表1 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片中Cry1Ac毒蛋白含量的影響

同列不同小寫字母代表相同年份內(nèi)不同處理間在＜0.05水平差異顯著。下同

Different letters in the same column represent significant difference at＜0.05 in the same year. The same as below

2.2 晝夜變溫下高溫干旱影響B(tài)t棉葉片Cry1Ac毒蛋白含量的生理機制

2.2.1基因表達量（ELBG） 隨著持續(xù)脅迫期延長，ELBG呈逐漸下降趨勢（圖1）。處理間相比，各時期均以A1B2處理表達量最高，A1B1處理次之，A2B1、A2B2處理再次，CK最低。說明高溫與干旱互作脅迫引起葉片中基因表達的上調(diào)。品種間相比（2020年）表明，脅迫后SK-3葉片中ELBG上升幅度比SK-1更大。

2.2.2 單寧含量 不同處理間單寧含量差異顯著（表2）。與CK相比，晝夜變溫下高溫干旱處理各時期葉片中單寧含量高于CK，如脅迫10 d后，SK1和SK3的A1B1、A1B2、A2B1、A2B2處理分別比各自CK上升33.2%、22.8%、98.3%、66.6%和236.5%、53.9%、300.9%、143.5%。且隨脅迫時間延長，單寧含量上升幅度逐漸增大。品種間相比，雜交種SK-3葉片中單寧含量上升幅度比常規(guī)種SK-1更大。

圖中不同字母代表不同處理間在＜0.05水平差異顯著 Different letters in the figures represent significant difference at＜0.05

圖1 晝夜變溫下高溫與干旱互作對棉鈴葉片中基因表達量的影響

Fig. 1 Effects of high temperature and drought ongene expressions in branch leaves

表2 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片單寧含量的影響

2.2.3 氮代謝生理

2.2.3.1 可溶性蛋白（SP）和游離氨基酸（aa）含量 SP和aa含量在晝夜變溫下高溫與干旱脅迫下變化基本相似（表3）。隨脅迫天數(shù)推移，兩者含量均呈逐漸下降趨勢。與CK相比，A1B2處理下降幅度最小，A1B1處理其次，A2B2、A2B1處理下降幅度最大。且隨著脅迫時間的延長，SP含量和aa含量下降的幅度總體呈逐漸上升趨勢。如2020年脅迫4 d、7 d、10 d后，SK-1的A1B2處理的SP含量分別比CK下降6.2%、14.9%和30.4%。品種間相比，雜交種SK-3葉片中SP含量下降幅度總體比常規(guī)種SK-1大，但aa含量下降幅度比SK-1小。

表3 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片中SP和aa含量的影響

2.2.3.2 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性 晝夜變溫下高溫干旱脅迫對GPT和GOT活性影響基本一致（表4）。其中A1B2處理在脅迫4 d內(nèi)GPT和GOT活性與CK基本無顯著差異；而其他處理則在脅迫4 d后出現(xiàn)顯著下降。但在脅迫7 d后均顯著低于CK，且隨著脅迫天數(shù)推移呈逐漸下降趨勢。品種間相比，常規(guī)種SK-1總體下降幅度比雜交種SK-3更大。

表4 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片中GPT和GOT活性的影響

2.2.3.3 谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）活性 各處理棉鈴葉片中GS活性和GOGAT活性均隨著脅迫天數(shù)的推移呈逐漸下降趨勢（表5）。兩年間所有處理各時期棉鈴葉片中GS和GOGAT活性均低于CK，但A1B2處理在脅迫4d時與CK基本無顯著差異；而A2B1、A2B2處理則在脅迫4 d后出現(xiàn)顯著下降。品種間相比，常規(guī)種SK-1葉片中GOGAT活性下降幅度比雜交種SK-3更大。

2.2.3.4 硝酸還原酶（NR）活性 表6表明，兩年所有處理各時期棉鈴葉片中NR活性均顯著低于CK。品種間相比，常規(guī)種SK-1葉片中NR活性下降幅度總體比雜交種SK-3更大。

2.2.3.5 蛋白酶和肽酶活性 蛋白酶破壞了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，將蛋白質(zhì)水解成多肽，并不破壞肽鍵，而肽酶是一類肽鏈內(nèi)切酶，負責切開肽鏈內(nèi)部的鍵，將蛋白質(zhì)的肽鏈徹底水解為氨基酸。表7表明，晝夜變溫下高溫與干旱導致棉葉片中蛋白酶和肽酶活性均增加。但A2B1處理增加幅度最大，A2B2處理次之，A1B1處理再次，A1B1處理最小。品種間相比，常規(guī)種SK-1葉片中蛋白酶活性上升幅度比雜交種SK-3更大。

2.3 各生理指標與葉片中Cry1Ac毒蛋白含量的關(guān)系

相關(guān)性分析表明，ELBG與Cry1Ac毒蛋白含量無顯著相關(guān)性。SP、aa含量、GOT、GPT、GS、GOGAT、NR活性等與Cry1Ac毒蛋白含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，而單寧含量、蛋白酶和肽酶活性則與其呈極顯著負相關(guān)（圖2）。以Cry1Ac毒蛋白含量（）為因變量，SP（1）、aa（2）、GOT（3）、GPT（4）、GS（5）、GOGAT（6）、NR（7）和單寧含量（8）、蛋白酶（9）和肽酶活性（10）、ELBG（11）為自變量進行逐步回歸分析，回歸方程決定系數(shù)為2= 0.913（表8）。說明篩選出來的指標是能夠反映棉Cry1Ac毒蛋白含量高低的主要因素，為進一步明確逐步回歸確定的指標對Cry1Ac毒蛋白含量的效應(yīng)，對篩選出的指標對Cry1Ac毒蛋白含量（）進行通徑分析，結(jié)果表明，篩選出NR（7）、GPT（4）、GS（5）等3個關(guān)鍵指標，且三者對Cry1Ac毒蛋白含量有較大的正效應(yīng)，其中NR的直接正效應(yīng)最大，達0.911（表9）。

表5 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片GS和GOGAT活性的影響

表6 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片NR活性的影響

表7 晝夜變溫下高溫與干旱互作對葉片蛋白酶和肽酶活性的影響

Bt protein、ELBG、SP、aa、GPT、GOT、GS、GOGAT和NR分別代表毒蛋白、Bt基因表達量、可溶性蛋白、游離氨基酸、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶和硝酸還原酶

表8 逐步回歸分析結(jié)果

：Cry1Ac毒蛋白含量Cry1Ac protein content；X：NR活性NR activity；X：GPT活性GPT activity；X：GS活性GS activity

表9 關(guān)鍵生理指標的通徑分析

3 討論

3.1 晝夜變溫下高溫與干旱脅迫降低Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量

筆者前期研究表明，晝夜恒溫下高溫和干旱互作逆境對棉Cry1Ac毒蛋白含量有明顯的影響[5]，但晝夜恒溫往往不能反映實際生產(chǎn)中的情況。本文在此基礎(chǔ)上，進一步研究晝夜變溫下高溫與干旱脅迫對棉抗蟲性影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晝夜變溫下高溫與干旱脅迫可降低泗抗1號和泗抗3號葉片中Cry1Ac毒蛋白含量，且隨著脅迫時間延長，下降幅度逐漸增大。這與筆者前期研究一致，但是顯著下降的時間上出現(xiàn)差異。前人研究發(fā)現(xiàn)，晝夜持續(xù)38℃脅迫棉株24 h后，泗抗1號和泗抗3號鈴殼中Cry1Ac毒蛋白含量顯著低于對照（32℃）[20]。但本研究中，在38℃（白天）/28℃（夜間）和土壤水分含量為田間土壤最大持水量50%（A2B1）、60%（A2B2）條件下，泗抗1號和泗抗3號葉片中Cry1Ac毒蛋白含量在受脅迫4 d時出現(xiàn)顯著下降。34℃/28℃和田間土壤最大持水量50%條件（A1B1）下，脅迫4 d后開始顯著低于對照。34℃/28℃和田間土壤最大持水量60%條件（A1B2）脅迫7—10 d內(nèi)與對照無顯著差異?？梢娕c晝夜持續(xù)高溫相比，棉在晝夜變溫的高溫與干旱脅迫下葉片中Cry1Ac毒蛋白含量下降速度顯著降低，這可能是由于夜間溫度變?yōu)檎囟龋?8℃）時，棉株受到脅迫得以緩解，體內(nèi)生理代謝水平趨于正常，生長有一定程度恢復[21-22]，葉片中Cry1Ac毒蛋白含量也隨之升高。正如劉震宇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，38℃脅迫72 h終止后，棉經(jīng)48 h殺蟲蛋白表達量可以恢復至對照水平。在本研究中，雖然白天12 h 34—38℃高溫脅迫易導致棉Cry1Ac毒蛋白含量不同程度下降，但在夜間由于脅迫終止，經(jīng)過12 h后Cry1Ac毒蛋白含量可能有所恢復。如此循環(huán)，最終導致Bt棉在晝夜變溫的高溫與干旱脅迫下葉片中Cry1Ac毒蛋白含量下降速度顯著降低且下降時間有所推遲。但上述推論還有待進一步驗證。

品種間相比，雜交種SK-3對高溫與干旱互作脅迫有更強的抗逆性。這與前人研究[23]一致，因此生產(chǎn)實踐中可以更多選擇雜交種種植。

綜上所述，晝夜變溫研究更反映實際大田情況，可以更好地指導生產(chǎn)。如遇白天34℃的高溫天氣，應(yīng)結(jié)合田間土壤水分含量制定棉鈴蟲防治策略；但當白天溫度達到或超過38℃，且脅迫超過4 d時，必須提前進行打藥，加強人工對棉鈴蟲等害蟲的防治。此外，生產(chǎn)中如遇到高溫干旱年份，可優(yōu)先考慮選用雜交種來提高棉花自身抗逆性以減少后期農(nóng)藥使用，節(jié)約成本。

3.2 NR、GPT、GS活性是決定Bt棉Cry1Ac毒蛋白含量高低的關(guān)鍵指標

前人研究認為，逆境易導致棉基因表達量下降，從而引起Cry1Ac毒蛋白含量降低[24]。但本文中，晝夜變溫下高溫與干旱互作并未使得葉片中基因表達量下降，反而呈上升趨勢，說明此逆境條件下mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，即在轉(zhuǎn)錄水平上并未導致基因表達量下降，與ZHANG等[12]研究結(jié)果一致，即基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是2 個相對獨立的過程，而且相關(guān)性較低。從mRNA到蛋白質(zhì)合成是一個復雜的調(diào)控過程，盡管高溫干旱條件下mRNA 水平轉(zhuǎn)錄水平提高，但有可能翻譯效率有所下降，導致最終Cry1Ac毒蛋白含量降低。但隨脅迫時間延長，所有處理基因表達量也在逐漸下降，說明棉花生長后期抗蟲性下降可能與基因表達量降低有關(guān)，這與生產(chǎn)中出現(xiàn)的棉生長后期抗蟲性降低相符合，但這并不是高溫干旱脅迫引起Cry1Ac毒蛋白含量下降的原因。

單寧廣泛存在于植物中，易與蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)形成沉淀復合物。已有研究表明，棉花中縮合單寧和Cry1Ac毒蛋白之間可能有一定拮抗作用，Cry1Ac毒蛋白表達會影響棉花中縮合單寧的合成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫與干旱脅迫后葉片中單寧含量顯著提高，且與Cry1Ac毒蛋白含量呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，說明單寧含量增加可能也是高溫與干旱互作脅迫導致棉Cry1Ac毒蛋白含量下降的原因之一，但其影響機理還有待進一步研究。

Martins等[4]發(fā)現(xiàn)土壤含水量降低會降低植株中總可溶性蛋白和Cry1Ac毒蛋白的含量。陳德華等[26]、Yang等[27]研究發(fā)現(xiàn)土壤水分虧缺導致轉(zhuǎn)基因作物氮代謝關(guān)鍵合成酶活性降低，分解酶活性升高。而Wang等[10]、Zhang等[20]、Olsen等[28]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫使蕾鈴中氨基酸含量顯著增加，SP含量和GPT活性顯著下降，蛋白酶活性則明顯提高。本研究與前人研究結(jié)果一致，晝夜變溫下高溫與干旱互作脅迫對棉棉鈴葉片中SP、aa含量、NR、GPT、GOT、GS和GOGAT等蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶活性的影響與Cry1Ac毒蛋白一致；而蛋白酶、肽酶等蛋白質(zhì)分解關(guān)鍵酶活性與蛋白含量的變化趨勢相反。

綜上所述，NR、GPT、GS活性是間接反映晝夜變溫的高溫與干旱逆境下棉Cry1Ac毒蛋白含量高低的關(guān)鍵指標，并以NR活性直接作用最大。生產(chǎn)中，棉花花鈴期應(yīng)該主要通過提高NR、GPT、GS活性，以提高葉片Cry1Ac毒蛋白含量，該指標還可為高抗蟲能力和高抗逆境品種的選育提供理論指導。

4 結(jié)論

與晝夜持續(xù)高溫相比，棉在晝夜變溫的高溫與干旱脅迫下葉片中Cry1Ac毒蛋白含量下降速度顯著降低。38℃（白天，7：00—19：00）/28℃（夜間，19：00—7：00）和土壤含水量為田間土壤最大持水量50%、60%脅迫4 d時，棉葉片中Cry1Ac毒蛋白含量顯著下降，而34℃/28℃和田間土壤最大持水量50%脅迫4 d后開始顯著低于對照，但34℃/ 28℃和田間土壤最大持水量60%脅迫7—10 d內(nèi)與對照無顯著差異。NR、GPT、GS活性是決定棉葉片中Cry1Ac毒蛋白含量高低的關(guān)鍵指標。生產(chǎn)中可通過調(diào)節(jié)上述3個酶的活性，來提高高溫干旱逆境下Cry1Ac毒蛋白含量。

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Cry1Ac Protein Content Responses to Alternating High Temperature Regime and Drought and Its Physiological Mechanism inCotton

YIN YanYu, XING YuTong, WU TianFan, WANG LiYan, ZHAO ZiXu, HU TianRan, CHEN Yuan, CHEN Yuan, CHEN DeHua, ZHANG Xiang

Yangzhou University/Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, Jiangsu

【Objective】This study was conducted to investigate the effects of alternating high temperature and drought on the content of Cry1Ac protein incotton and the underlying physiological mechanism, so as to provide a reference for the safe and stable utilization of insect resistance ofcotton in production.【Method】The conventional cultivar Sikang 1 (SK-1) and hybrid cultivar Sikang 3 (SK-3) were used in 2019 and 2020 in experimentally controlled greenhouse, Yangzhou University. From 7:00 am to 7:00 pm, two high-temperature treatments [34℃ (A1) and 38℃ (A2)] were imposed on cotton plants, followed by an optimum temperature 28℃ during the remaining night hours. There were two treatments for soil moisture content, which were 50% (B1) and 60% (B2) field capacity. The treatment with 32℃/28℃ and 75% field capacity was set as the control (CK). The leaf Cry1Ac protein content and its physiological mechanism were detected on 4, 7, and 10 days after stress (DAS), respectively.【Result】Compared with CK, the Cry1Ac protein content all decreased under the stresses of high temperature and drought, and with the extension of the stress time, greater decrease was observed. The extent of decline for A1B2 was the smallest, followed by A1B1, while A2B1 and A2B1 were the largest. The Cry1Ac protein content under A1B2 was significantly lower than CK after 7 DAS, while the significant differences between A1B1, A2B2, A2B2 and CK were detected after 4 DAS. Thegene expression level, soluble protein (SP), free amino acid (aa) contents, nitrate reductase (NR), the glutamic pyruvic transaminase (GPT), glutamic oxaloacetate transaminase (GOT), glutamine synthetase (GS) and glutamate synthase (GOGAT) activities showed a downward trend. While the tannin content, the activities of protease and peptidase showed an upward trend. The correlation analysis and path analysis showed SP, aa, NR, GPT, GOT, GS, and GOGAT were positively correlated with Cry1Ac protein content. The tannin content, activities of protease, and peptidase were negatively correlated with Cry1Ac protein content. NR, GPT and GS could be key indices for the Cry1Ac protein content.【Conclusion】The interaction of high temperature and drought resulted in the decrease ofCry1Ac protein content incotton, with greater decrease observed as the stress extended. There was no significant difference between the treatment with 34℃/28℃ and 60% field capacity and CK in 7-10 DAS. The reduction extent of Cry1Ac for alternating high temperature regime and drought decreased and the period was delayed. NR, GPT and GS could be key indices for the Cry1Ac protein content.

cotton; Cry1Ac protein; high temperature; drought; physiological mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.004

2022-01-04；

2022-04-19

江蘇省高等學校自然科學研究（22KJA210005）、國家自然科學基金（31901462）、揚州大學大學生科創(chuàng)基金（X20210630，X20210607）、江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程、江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程（PPZY2015A060）

尹彥雨，E-mail：2026231662@qq.com。通信作者陳德華，E-mail：cdh@yzu.edu.cn。通信作者張祥，E-mail：zhangxiang@yzu.edu.cn

（責任編輯 楊鑫浩）