李寧，柳坤，劉彤彤，史雨剛，王曙光，楊進(jìn)文，孫黛珍

小麥響應(yīng)干旱脅迫環(huán)狀RNA的鑒定

李寧，柳坤，劉彤彤，史雨剛，王曙光，楊進(jìn)文，孫黛珍

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801

【目的】干旱是限制全球小麥生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一，探索小麥應(yīng)對(duì)干旱的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)小麥分子育種具有重要意義。環(huán)狀RNA（circRNA）已被證實(shí)在植物抵御外界環(huán)境脅迫的過程中扮演著重要角色。鑒定小麥響應(yīng)干旱脅迫的circRNA，有助于構(gòu)建小麥干旱脅迫響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析小麥的抗旱性機(jī)制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳?個(gè)抗旱性差異顯著的小麥品種（周麥13和冀麥38）為試驗(yàn)材料，對(duì)其在干旱及對(duì)照條件下的根部樣本進(jìn)行circRNA測(cè)序。鑒定小麥circRNA并對(duì)其進(jìn)行特征分析，篩選與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)circRNA，并對(duì)其靶向microRNA（miRNA）進(jìn)行預(yù)測(cè)。進(jìn)一步根據(jù)miRNA及其靶基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式，構(gòu)建小麥響應(yīng)干旱脅迫的潛在circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊?！窘Y(jié)果】共鑒定獲得1 409個(gè)小麥circRNA，其中，多數(shù)（68.91%）為外顯子circRNA，且僅有133個(gè)circRNA在2個(gè)品種中被同時(shí)鑒定獲得。在干旱脅迫下共鑒定獲得239個(gè)差異表達(dá)circRNA，其中138個(gè)circRNA在抗旱型品種周麥13（ZM13）中特異性差異表達(dá)，19個(gè)circRNA在2個(gè)品種中同時(shí)差異表達(dá)。共預(yù)測(cè)到34個(gè)靶向miRNA以及1 408個(gè)miRNA靶基因。根據(jù)這些差異表達(dá)circRNA、靶向miRNA以及miRNA靶基因在干旱脅迫后的表達(dá)模式，共篩選出5個(gè)分別以tae-miR9664-3p、tae-miR1122b-3p、tae-miR9662a-3p、tae-miR6197-5p和tae-miR1120c-5p為中心的小麥響應(yīng)干旱脅迫的潛在circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊。【結(jié)論】小麥circRNA具有明顯的品種特異性，且在不同抗旱型小麥品種之間具有不同的表達(dá)模式。共鑒定到239個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的小麥circRNA以及5個(gè)潛在的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊。

小麥；circRNA；干旱脅迫；miRNA

0 引言

【研究意義】干旱是全球糧食生產(chǎn)所面臨的嚴(yán)重自然災(zāi)害之一[1]，提高作物的抗旱能力是廣大育種工作者的主要研究方向。小麥（L.）是世界三大糧食作物之一，挖掘其響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并分析其遺傳基礎(chǔ)，對(duì)小麥耐旱性分子設(shè)計(jì)育種和耐旱性機(jī)制解析具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類閉合的非線性RNA分子，主要由pre-mRNA通過可變剪切加工產(chǎn)生，大量存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中[2]。由于高通量測(cè)序和高效生物信息學(xué)分析技術(shù)的不斷突破，研究人員已經(jīng)在小鼠、人類、古細(xì)菌和秀麗隱桿線蟲等物種中相繼鑒定出了大量的circRNA[3]。對(duì)其特征分析結(jié)果表明，circRNA可以來自外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域，且其表達(dá)模式通常在不同組織和發(fā)育階段存在特異性[4]。此外，有證據(jù)表明circRNA比線性RNA要更加穩(wěn)定，因此，它們可能通過一些特殊的方式參與生命活動(dòng)過程[4]。近年來，circRNA在動(dòng)物中研究最多的功能之一是它可以與microRNA（miRNA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，來調(diào)節(jié)其靶基因的功能。如，Zheng等[5]研究表明，人類中的有18個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以與9個(gè)miRNA相結(jié)合。此外，Wang等[6]研究證實(shí)，與心臟相關(guān)的circRNA（）可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）與miR-223相結(jié)合并抑制其活性。此外，在人類中的研究證實(shí)，一些circRNA可以通過特定的相互作用關(guān)系來促進(jìn)其宿主基因在順式作用中的表達(dá)[7]。與動(dòng)物相比，人們對(duì)植物中circRNA鑒定的研究相對(duì)較少。2014年，Wang等[8]首次在植物中進(jìn)行了circRNA鑒定，并且發(fā)現(xiàn)了擬南芥中存在circRNA的明確證據(jù)。之后，Ye等[9]通過全基因組水平的檢測(cè)，在水稻（）和擬南芥中分別鑒定出12 037和6 012個(gè)circRNA，證實(shí)circRNA在單子葉植物和雙子葉植物中均廣泛存在。后來，研究人員相繼在番茄[10]、馬鈴薯[11]、小麥[12]、大豆[13]、茶[14]、大麥[15]和玉米[16]中鑒定到circRNA。盡管人們已經(jīng)在植物中鑒定到大量的circRNA，但迄今為止，關(guān)于circRNA在植物當(dāng)中的功能研究十分有限。Tan等[17]在番茄中過表達(dá)一個(gè)來自類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因（）的circRNA，可導(dǎo)致番茄紅素合成酶基因的表達(dá)降低以及番茄紅素和β-胡蘿卜素的積累減少。Cheng等[18]過量表達(dá)了一個(gè)來自AT5G37720第一個(gè)內(nèi)含子的circRNA，可以改變約800個(gè)基因的表達(dá)并最終影響了擬南芥的發(fā)育。此外，越來越多研究表明，circRNA在調(diào)節(jié)植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。在水稻中鑒定到27個(gè)在磷酸鹽充足和饑餓條件下差異表達(dá)的外顯子circRNA[9]。Pan等[19]在熱脅迫條件下的擬南芥中鑒定到的circRNA數(shù)量比正常條件下要多，推測(cè)其可能通過由circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與植物對(duì)熱脅迫的反應(yīng)。Wang等[12]在小麥葉片中鑒定到88個(gè)circRNA，其中66個(gè)在脫水脅迫后差異表達(dá)，并且從這些差異表達(dá)circRNA中預(yù)測(cè)到26個(gè)靶向miRNA?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管在小麥中已進(jìn)行了相關(guān)circRNA的鑒定，但鑒于circRNA在不同品種間的特異性，仍需對(duì)其進(jìn)行大量的鑒定工作來完善小麥circRNA信息。此外，本研究在鑒定小麥circRNA的基礎(chǔ)上，充分利用本研究組前期在相同小麥品種中已獲得的miRNA及mRNA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，快速構(gòu)建了小麥響應(yīng)干旱脅迫的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用2個(gè)不同抗旱型小麥品種為試驗(yàn)材料，對(duì)小麥circRNA進(jìn)行鑒定和特征分析，并進(jìn)一步鑒定在干旱脅迫后差異表達(dá)的circRNA，篩選小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的潛在circRNA-miRNA-mRNA模塊，為探索小麥響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其circRNA的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和干旱處理方法

2個(gè)小麥（L.）品種分別為周麥13（ZM13）和冀麥38（JM38）。ZM13是一個(gè)抗旱型品種，JM38是一個(gè)干旱敏感型品種[20]。小麥種子經(jīng)75%乙醇溶液消毒2 min，再用2% H2O2消毒30 min，無菌水洗滌3次[21]。室溫條件下，將種子置于蒸餾水中發(fā)芽3 d，然后轉(zhuǎn)移至96孔塑料水培盒（13 cm×8.5 cm×11 cm），光照培養(yǎng)箱（22℃光照14 h/20℃黑暗10 h）中培養(yǎng)[22]。待幼苗培養(yǎng)7 d（一葉一心期）后，對(duì)其進(jìn)行干旱處理，干旱溶液為20% PEG-6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照，3次試驗(yàn)重復(fù)。

1.2 總RNA提取和circRNA測(cè)序

干旱脅迫4 d時(shí)，收集2個(gè)品種CK和干旱處理的幼苗根部，每個(gè)樣本分別由3株幼苗全部根系混合而成，每個(gè)品種每個(gè)處理3次重復(fù)，共計(jì)12個(gè)樣本，液氮冷凍，-80℃保存。按照Yin等[10]方法進(jìn)行總RNA的提取和濃度的測(cè)定。利用Ribo-Zero rRNA Removal Kit（Epicentre, Madison, WI, USA）去除總RNA中的核糖體RNA，利用RNase R（Epicentre, Madison, WI, USA）去除線性RNA，構(gòu)建circRNA-seq文庫[10]。委托北京百邁客生物科技有限公司利用Illumina nova-seq 6000平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3 circRNA的鑒定和表達(dá)分析

首先去除原始數(shù)據(jù)（raw data）中未知（N）堿基超過5%、包含接頭序列以及低質(zhì)量堿基（Q≤20）超過50%的低質(zhì)量read。使用HISAT軟件[23]將高質(zhì)量的read（clean read）與小麥參考基因組（IWGSC_ RefSeq_v1.1.Triticum_aestivum.）進(jìn)行序列比對(duì)。利用find_circ軟件[24]進(jìn)行circRNA鑒定。參照Zhu等[25]方法，將每個(gè)circRNA在樣本中的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用DESeq2[26]軟件進(jìn)行circRNA的差異表達(dá)分析，差異表達(dá)circRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2(Fold change)|＞1且＜0.05。

1.4 circRNA-miRNA靶向關(guān)系預(yù)測(cè)、miRNA靶基因預(yù)測(cè)和基因的功能注釋

使用Target Finder軟件[27]預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA的miRNA結(jié)合位點(diǎn)并對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)circRNA的宿主基因進(jìn)行KEGG注釋。利用小麥多組學(xué)網(wǎng)站W(wǎng)heatOmics 1.0（WheatOmics sdau.edu.cn）[28]鑒定宿主基因在水稻中的同源基因，并利用國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（www.ricedata. com）查詢同源基因的已知功能。使用BLAST2GO軟件[29]對(duì)宿主基因進(jìn)行GO注釋。使用Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行功能注釋。

1.5 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊預(yù)測(cè)方法

利用本研究組已鑒定到的JM38和ZM13在干旱脅迫下的miRNA數(shù)據(jù)[20]（NCBI，SRA數(shù)據(jù)庫，BioProject PRJNA837867）分析本研究中差異表達(dá)circRNA的靶向miRNA在干旱脅迫下的表達(dá)模式，從中篩選出差異表達(dá)的靶向miRNA。之后同樣利用本研究組已鑒定到的JM38和ZM13在干旱脅迫下的mRNA數(shù)據(jù)[20]（NCBI，SRA數(shù)據(jù)庫，BioProject PRJNA838787）分析本研究中靶向miRNA的靶基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式，從中篩選出差異表達(dá)的靶基因。然后根據(jù)靶基因的注釋功能及同源基因的已知功能對(duì)其進(jìn)行篩選。最終構(gòu)建以差異表達(dá)circRNA為基礎(chǔ)，與其存在靶向關(guān)系且差異表達(dá)的miRNA為中心，以及根據(jù)注釋功能選擇的差異表達(dá)靶基因?yàn)槟繕?biāo)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊，作為小麥響應(yīng)干旱脅迫的潛在circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控模塊。

1.6 差異表達(dá)circRNA的驗(yàn)證

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對(duì)隨機(jī)選擇的9個(gè)差異表達(dá)circRNA的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。按照Trizol試劑說明書提取總RNA，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific, USA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成。使用SYBR Green Master Mix在CFX 96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Bio-Rad）上進(jìn)行qRT-PCR分析。采用2?ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)circRNA的相對(duì)表達(dá)量。以小麥管家基因作為內(nèi)參基因[12]，所用引物的信息見表1。

2 結(jié)果

2.1 小麥中circ RNA的鑒定

為鑒定小麥中的circRNA，提取這兩個(gè)品種在對(duì)照及干旱脅迫4 d后的根部樣本進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，從12個(gè)樣本中共獲得約210.36 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean data），單個(gè)樣品的clean data在14.50 Gb以上，且每個(gè)樣本高質(zhì)量read（clean read）的Q30均能達(dá)到93.01%以上，進(jìn)一步說明該測(cè)序結(jié)果的可靠性。與小麥參考基因組的比對(duì)結(jié)果顯示，各樣品clean read的比對(duì)效率從98.74%到99.79%不等（表2）。

表1 熒光定量PCR引物序列

表2 circRNA測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

a：CK：對(duì)照條件下的樣本；T：干旱條件下的樣本；1—3分別代表3個(gè)不同重復(fù)

a: CK: samples under control conditions; T: samples under drought conditions; 1-3 represent three different repetitions

利用circRNA預(yù)測(cè)工具find_circ在12個(gè)測(cè)序樣本中共鑒定到1 409個(gè)circRNA，其中，在干旱敏感品種JM38中鑒定到722個(gè)circRNA，在抗旱品種ZM13中鑒定到820個(gè)circRNA（圖1-A）。此外，在1 409個(gè)circRNA中，有589和687個(gè)circRNA分別在JM38和ZM13中特異性表達(dá)，僅有133個(gè)circRNA在2個(gè)品種中均被鑒定到（圖1-A），表明circRNA在小麥中具有較高的品種特異性。

2.2 小麥circRNA的特征分析

基因組起源分析顯示，在1 409個(gè)已鑒定到的circRNA中，多數(shù)（971個(gè)，68.91%）是外顯子circRNA，其次，有299個(gè)（21.22%）是基因間circRNA，其余139個(gè)（9.87%）為內(nèi)含子circRNA（圖1-B）。在染色體分布方面，circRNA主要分布在小麥5B、1B、2A、2B以及3B等染色體上（圖1-C）。關(guān)于circRNA長(zhǎng)度的變異情況，大多數(shù)circRNA（1 079個(gè)，76.58%）的長(zhǎng)度低于800 bp（圖1-D）。此外，大部分（78.69%）長(zhǎng)度大于2 600 bp的長(zhǎng)circRNA屬于基因間circRNA（圖1-D）。

A：2個(gè)品種中circRNA數(shù)量的韋恩圖；B：由外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域產(chǎn)生的circRNA的數(shù)量和百分比；C：circRNA在小麥染色體上的分布；D：小麥circRNA的長(zhǎng)度分布

2.3 干旱脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)circRNA

為鑒定響應(yīng)干旱脅迫的小麥circRNA，比較了2個(gè)品種的對(duì)照和干旱處理之間circRNA的表達(dá)譜。在所有鑒定到的1 409個(gè)circRNA中，有239個(gè)circRNA在干旱脅迫下存在顯著差異表達(dá)，其中，在干旱敏感型品種JM38中共鑒定到91個(gè)差異表達(dá)的circRNA，在抗旱品種ZM13中共鑒定到157個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中138個(gè)circRNA在ZM13中特異性差異表達(dá)，19個(gè)circRNA在2個(gè)品種中同時(shí)差異表達(dá)（圖2-A）。此外，值得注意的是，在JM38中更多的circRNA下調(diào)表達(dá)（55個(gè)，60.44%），而在ZM13中，有88%以上（139個(gè)，88.54%）的circRNA均為上調(diào)表達(dá)（圖2-B）。說明circRNA在不同抗旱型小麥品種中存在不同的表達(dá)模式。

為驗(yàn)證circRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，利用qRT-PCR方法從239個(gè)差異表達(dá)circRNA中隨機(jī)選擇9個(gè)circRNA進(jìn)行差異表達(dá)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，除了2個(gè)circRNA（chr3D:456098361|456098885和chr3B:438537516|438537814）以外，其余7個(gè)circRNA在2種試驗(yàn)方法中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式（圖3），這可能是由于其絕對(duì)表達(dá)量較低或2種不同的表達(dá)模式計(jì)算方法所造成的結(jié)果。

2.4 差異表達(dá)circRNA宿主基因的生物學(xué)功能分析

circRNA可通過對(duì)其宿主基因的順式調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄控制中發(fā)揮重要作用[7]。在2個(gè)品種中差異表達(dá)的239個(gè)circRNA中共鑒定出182個(gè)宿主基因。為了解這些差異表達(dá)circRNA的生物學(xué)功能，首先對(duì)宿主基因進(jìn)行了GO注釋分析。結(jié)果顯示，共有114個(gè)宿主基因被注釋到30個(gè)不同的GO分類上（圖4-A）。分別按照生物過程、細(xì)胞成分和分子功能對(duì)這些GO類別進(jìn)行分類。注釋到較多宿主基因的生物過程有：代謝過程（GO：0008152）、細(xì)胞過程（GO：0009987）、單有機(jī)體過程（GO：0044699）和刺激響應(yīng)（GO：0050896）。注釋到較多宿主基因的細(xì)胞成分類別有：膜（GO：0016020）、細(xì)胞（GO：0005623）、膜組分（GO：0044425）、細(xì)胞器（GO：0043226）和大分子復(fù)合物（GO：0032991）。注釋到較多宿主基因的分子功能類別有：結(jié)合（GO：0005488）、催化活性（GO：0003824）、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0001071）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0005215）和抗氧化活性（GO：0016209）（圖4-A）。

A：2個(gè)品種中差異表達(dá)circRNA數(shù)量的韋恩圖；B：2個(gè)品種中上調(diào)表達(dá)circRNA和下調(diào)表達(dá)circRNA的數(shù)量；C：差異表達(dá)circRNA在2個(gè)品種中的表達(dá)熱圖，數(shù)字代表log2(fold change)值

其次，分析了在抗旱品種ZM13中特異性差異表達(dá)circRNA的宿主基因的GO注釋結(jié)果，共鑒定出110個(gè)宿主基因，其中，共有69個(gè)宿主基因被注釋到28個(gè)不同的GO類別上。和所有差異表達(dá)circRNA宿主基因的GO注釋結(jié)果相似，注釋到較多宿主基因的GO類別有：結(jié)合、催化活性、代謝過程、細(xì)胞過程、膜、細(xì)胞和膜組分等（圖4-B）。

此外，對(duì)2個(gè)品種中共同差異表達(dá)的19個(gè)circRNA的宿主基因進(jìn)行GO注釋分析，共鑒定出14個(gè)宿主基因，其中有8個(gè)宿主基因被注釋到20個(gè)不同的GO類別上（表3）。除了上文中提到的主要GO類別以外，注釋到宿主基因數(shù)量在2個(gè)及2個(gè)以上的GO類別還有生物調(diào)節(jié)（GO：0065007）以及細(xì)胞外區(qū)域（GO：0005576）（表3）。

通過利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)所有的差異表達(dá)circRNA宿主基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步注釋。結(jié)果顯示，共有67個(gè)宿主基因被注釋到36個(gè)不同的KEGG通路上。包括植物-病原菌互作（ko04626）、內(nèi)吞作用（ko04144）、真核生物中的核糖體生物發(fā)生（ko03008）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）、苯丙烷生物合成（ko00940）和過氧化物酶體（ko00190）等（表4）。通過對(duì)ZM13中特異性差異表達(dá)circRNA的宿主基因進(jìn)行了KEGG注釋，結(jié)果顯示，共有38個(gè)宿主基因被注釋到86個(gè)不同的KEGG通路上（表5）。其中，富集到較多宿主基因的通路包括：植物-病原菌互作、內(nèi)吞作用和過氧化物酶體等。此外同樣對(duì)2個(gè)品種中共同差異表達(dá)circRNA的宿主基因進(jìn)行KEGG注釋。結(jié)果顯示，共有7個(gè)宿主基因被注釋到7個(gè)不同的KEGG通路上（表6）。

圖3 差異表達(dá)circRNA的表達(dá)模式驗(yàn)證

表3 2個(gè)品種中共同差異表達(dá)circRNA的宿主基因的GO注釋

僅列出基因數(shù)量大于等于2的GO term Only GO terms with a No. of genes greater than or equal to 2 are listed

表4 全部差異表達(dá)circRNA宿主基因的KEGG注釋

僅列出基因數(shù)量大于等于2的通路 Only pathways with a No. of genes greater than or equal to 2 are listed

A：兩品種中所有差異表達(dá)circRNA宿主基因的GO注釋結(jié)果；B：ZM13中特異性差異表達(dá)circRNA宿主基因的GO注釋結(jié)果

A: GO annotation of host genes of all differentially expressed circRNAs; B: GO annotation of host genes of differentially expressed circRNAs specifically in ZM13

圖4 差異表達(dá)circRNA宿主基因的GO注釋

Fig. 4 GO annotation of host genes of differentially expressed circRNAs

此外，對(duì)所有宿主基因在水稻中的同源基因進(jìn)行比對(duì)。通過查詢這些同源基因的生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)，其中，來自9個(gè)宿主基因的10個(gè)水稻同源基因已被證實(shí)在水稻抵御多種非生物脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用（表7）。

2.5 差異表達(dá)circRNA的靶向miRNA預(yù)測(cè)

circRNA可以通過與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，來阻止miRNA調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)[6]。通過對(duì)circRNA的靶向miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有24個(gè)差異表達(dá)circRNA（其中，12個(gè)circRNA在ZM13中特異性差異表達(dá)，3個(gè)circRNA在2個(gè)品種中同時(shí)差異表達(dá)）預(yù)測(cè)到miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并鑒定出34個(gè)不同的靶向miRNA（表8）。在所有差異表達(dá)的circRNA中，chr1A: 589450964|589476548具有最多的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，為7個(gè)；其次是chr5B:528574134|528588868，具有6個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)；chr3B:778404617|778442815、chr6D: 454657953|454748495、chr7B:1308928|1352258和chr4D: 65120787|65147651均各具有5個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)（表8）。此外，還發(fā)現(xiàn)miRNA的靶向circRNA也不是唯一的，也就是說多個(gè)circRNA可能會(huì)具有同一個(gè)靶向miRNA。如tae-miR1117和tae-miR1133都具有7個(gè)靶向circRNA。在2個(gè)品種中同時(shí)差異表達(dá)的3個(gè)circRNA（chr5A:482358772|482427161、chr2B:787486469| 787538256和chr4A:668278340|668323672）共預(yù)測(cè)到5個(gè)靶向miRNA（表8）。

表5 ZM13中特異性差異表達(dá)circRNA的宿主基因的KEGG注釋

僅列出基因數(shù)量大于等于2的通路 Only pathways with a No. of genes greater than or equal to 2 are listed

表6 2個(gè)品種中共同差異表達(dá)circRNA的宿主基因的KEGG注釋

表7 差異表達(dá)circRNA宿主基因在水稻中的同源基因及其抗逆性功能

表8 差異表達(dá)circRNA及其靶向miRNA

circRNA ID斜體代表其在ZM13中特異性差異表達(dá)，circRNA ID加粗代表在2個(gè)品種中同時(shí)差異表達(dá)

CircRNA IDs in italics represent their specific differential expression in ZM13, and circRNA IDs in bold represent differentially expressed in both varieties

2.6 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊預(yù)測(cè)

為了探索小麥響應(yīng)干旱脅迫的circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。首先利用本研究組已鑒定到的小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNA數(shù)據(jù)分析34個(gè)靶向miRNA在干旱脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，共有6個(gè)miRNA在干旱脅迫后差異表達(dá)，且均為上調(diào)表達(dá)（圖5-A—B）。其中tae-miR9664-3p和tae-miR7757-5p在2個(gè)小麥品種均上調(diào)表達(dá)（圖5-C）。然后利用Target Finder軟件對(duì)這6個(gè)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到1 408個(gè)靶基因。之后，同樣利用已鑒定到的小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的mRNA數(shù)據(jù)分析這1 408個(gè)靶基因干旱脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，共有261個(gè)靶基因在干旱脅迫后差異表達(dá)（圖5-D—F）。進(jìn)一步查詢這261個(gè)基因的注釋功能，從中篩選出32個(gè)可能與小麥脅迫響應(yīng)相關(guān)候選靶基因。它們的注釋功能有：過氧化物酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450、鈣依賴性蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白和水通道蛋白等（表9）。

綜上所述，最終構(gòu)建了5個(gè)小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的潛在circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊，其中，包括8個(gè)差異表達(dá)circRNA、5個(gè)差異表達(dá)的靶向miRNA以及32個(gè)差異表達(dá)的miRNA靶基因（表9）。其中模塊3中的circRNA（chr5D:543694782| 543696753）以及其的靶向miRNA（tae-miR9662a- 3p）均在抗旱型品種ZM13中特異性差異表達(dá)（表9）。

A、B：差異表達(dá)的靶向miRNA在2個(gè)品種中的分布；C：差異表達(dá)的靶向miRNA在2個(gè)品種中的表達(dá)模式；D、E：差異表達(dá)靶基因在2個(gè)品種中的分布；F：差異表達(dá)靶基因在2個(gè)品種中的表達(dá)模式

3 討論

3.1 小麥circRNA的鑒定與特征分析

circRNA是由下游剪接供體和上游剪接受體之間的非線性反向剪接事件所產(chǎn)生一類特殊的RNA。近年來，隨著circRNA-seq技術(shù)的發(fā)展，研究人員在動(dòng)物和植物中鑒定到了大量的circRNA。這些廣泛表達(dá)且高度保守的circRNA的發(fā)現(xiàn)增加了人們對(duì)于非編碼RNA潛在功能的認(rèn)識(shí)[40]。然而，與動(dòng)物相比，人們對(duì)植物中circRNA的生物發(fā)生和調(diào)控功能在很大程度上都是未知的[11]。Ye等[9]對(duì)水稻和擬南芥中的circRNA進(jìn)行了特征分析，并且發(fā)現(xiàn)植物circRNA的生物發(fā)生機(jī)制可能與動(dòng)物中的有所不同。此外，最近在水稻[9]、小麥[12]和馬鈴薯[11]上的研究表明，circRNA在調(diào)節(jié)植株對(duì)外界脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。

表9 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊

本研究分別對(duì)2個(gè)在抗旱性方面存在顯著差異的小麥品種進(jìn)行了circRNA測(cè)序，共鑒定到1 409個(gè)circRNA，其中，在干旱敏感品種JM38中鑒定到722個(gè)circRNA，在抗旱品種ZM13中鑒定到820個(gè)circRNA（圖1-A）。通過對(duì)比2個(gè)品種中鑒定到的circRNA，發(fā)現(xiàn)僅有133個(gè)（9.44%）circRNA在2個(gè)品種中被同時(shí)鑒定到，說明circRNA在小麥中具有明顯的品種特異性，這與前人研究的結(jié)果一致。本研究在小麥中鑒定到的circRNA數(shù)量要少于前人在水稻（26 160個(gè)）[9]、擬南芥（31 079個(gè)）[9]和大豆（5 372個(gè)）[13]中的鑒定結(jié)果，但要高于前人同樣在小麥（88個(gè)）[12]以及玉米（496個(gè)）[16]、茶（342個(gè)）[14]和番茄（854個(gè)）[10]中的鑒定結(jié)果，這可能是由于不同的研究中在物種、組織（例如葉、根、果實(shí)、莖、芽等）以及circRNA預(yù)測(cè)工具（例如CIRI2、fnd_circ、CIRCexplorer）上存在的差異所導(dǎo)致的結(jié)果[41]。此外，前人研究結(jié)果表明，circRNA可以在外顯子、內(nèi)含子和基因之間的區(qū)域產(chǎn)生，在水稻、擬南芥、茶和番茄的研究中，大多數(shù)已鑒定的circRNA是位于外顯子的circRNA[9, 14, 42]。本研究鑒定到的大多數(shù)小麥circRNA（971個(gè)，68.91%）同樣是外顯子circRNA（圖1-B）。

3.2 小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的circRNA

植物對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其中，涉及到許多干旱誘導(dǎo)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與。為了探索小麥circRNA在干旱脅迫響應(yīng)中的作用，本研究共鑒定到239個(gè)在干旱脅迫下存在顯著差異表達(dá)的circRNA。在這些差異表達(dá)的circRNA中，有超過一半（138個(gè)，57.74%）的circRNA僅來自于抗旱型品種ZM13中，還有19個(gè)circRNA同時(shí)來自于2個(gè)品種，只有72個(gè)（30.13%）circRNA在干旱敏感型品種JM38中特異性差異表達(dá)（圖2-A）。這可能是由于circRNA在小麥中的品種特異性所導(dǎo)致的結(jié)果。此外，值得的注意的是，在JM38中更多的circRNA下調(diào)表達(dá)（55個(gè)，60.44%），而在ZM13中，有88%以上（139個(gè)，88.54%）的circRNA均為上調(diào)表達(dá)（圖2-B）。這說明circRNA在不同抗旱型小麥品種中存在不同的表達(dá)模式。

本研究通過對(duì)這些差異表達(dá)circRNA的宿主基因進(jìn)行了GO和KEGG注釋分析。結(jié)果表明，包括刺激響應(yīng)、細(xì)胞膜組分、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和抗氧化活性等一些與干旱脅迫反應(yīng)相關(guān)的GO term都注釋到了較多的宿主基因（圖4）。此外，部分宿主基因也注釋到了一些重要的脅迫應(yīng)答通路：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成和過氧化物酶體等（表4）。

檢索circRNA宿主基因在其他作物中的同源基因的功能，可以為預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)circRNA的生物學(xué)功能提供一些幫助。通過查詢這些差異表達(dá)circRNA的宿主基因在水稻中的同源基因及其功能發(fā)現(xiàn)，其中，部分水稻同源基因已被證實(shí)在抵御多種非生物脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用（表7）。如chr7A:222784992| 222785194的宿主基因在水稻中的同源基因和可以提高植株對(duì)干旱以及鹽脅迫的耐受性[38-39]。差異表達(dá)circRNA chr2A:52664278|52664553、chr3A:638334965|638335214和chr6A:608632503|608632694宿主基因的同源基因均可提高水稻的耐鹽性[30, 32, 37]。此外，其余同源基因在植株抵御高溫、冷和營(yíng)養(yǎng)脅迫等過程扮演著重要的角色[31-36]（表7）。這些circRNA表達(dá)模式及功能預(yù)測(cè)結(jié)果，為挖掘小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的circRNA提供了重要依據(jù)。

3.3 小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的潛在circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控模塊

研究表明，circRNA可以通過與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性相合，來降低miRNA對(duì)靶基因的沉默效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)miRNA靶基因的表達(dá)[43]。為了探索與小麥干旱脅迫相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究構(gòu)建了5個(gè)可能與小麥干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的circRNA- miRNA-mRNA調(diào)控模塊（表9）。通過分析這些差異表達(dá)靶基因注釋功能，可以對(duì)于了解這些circRNA- miRNA-mRNA調(diào)控模塊的潛在功能提供一定的幫助。以tae-miR9664-3p為中心的第1個(gè)circRNA-miRNA- mRNA調(diào)控模塊中共篩選出10個(gè)差異表達(dá)的靶基因，其中的注釋功能為過氧化物酶；的注釋功能為乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子；此外還包括3個(gè)細(xì)胞色素P450基因，3個(gè)鈣依賴性蛋白激酶和2個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體A家族成員（表9）。眾所周知，過氧化物酶可通過催化H2O2的氧化還原來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)活性氧的平衡，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[44]。乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞發(fā)育、激素和逆境信號(hào)傳遞有關(guān)，在植物抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的調(diào)控作用[45]。細(xì)胞色素P450同樣被證實(shí)參與了植物多種生理代謝途徑，其次生代謝產(chǎn)物在植物體信號(hào)傳導(dǎo)以及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[46]。鈣依賴性蛋白激酶是植物中重要的一類Ca2+傳感器，在植物發(fā)育及多種脅迫響應(yīng)中均扮演重要角色[47-48]。以tae-miR1122b-3p為中心的第2個(gè)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊中共篩選出9個(gè)差異表達(dá)的靶基因，的注釋功能為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，同樣注釋為乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子；為生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白，是一個(gè)水通道蛋白（表9）。植物水通道蛋白是介導(dǎo)植物體內(nèi)水分跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，其廣泛存在于植物細(xì)胞膜上，具有調(diào)節(jié)植物開花、氣孔運(yùn)動(dòng)、生殖生長(zhǎng)、響應(yīng)多種逆境脅迫等功能[49]。此外，在水稻中的同源基因?yàn)?，Cao等[50]研究證實(shí)，過量表達(dá)可以提高煙草對(duì)鹽及干旱脅迫的抵抗能力。在水稻中的同源基因也被證實(shí)可以影響水稻的籽粒產(chǎn)量、耐鹽性、根部滲透系數(shù)及種子萌發(fā)率[51]。此外，值得注意的是，以tae-miR9662a-3p為中心的模塊3中的circRNA以及其靶向miRNA均只在抗旱型品種ZM13中特異性差異表達(dá)，其靶基因包括3個(gè)鋅指蛋白和1個(gè)富含半胱氨酸的受體蛋白激酶（表9）。該模塊對(duì)ZM13的抗旱性研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

除了上述基因外，這5個(gè)模塊中所涉及到的miRNA靶基因還包括1個(gè)富含半胱氨酸的受體蛋白激酶、3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、2個(gè)肉桂酰輔酶A還原酶和1個(gè)普遍脅迫蛋白（表9）。這些基因均可作為小麥脅迫響應(yīng)相關(guān)的候選靶基因。以上研究結(jié)果為探索小麥響應(yīng)干旱脅迫的circRNA- miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

共鑒定到1 409個(gè)小麥circRNA，其中多數(shù)為外顯子circRNA，且表現(xiàn)出明顯的品種特異性。共鑒定到239個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)circRNA，并預(yù)測(cè)到34個(gè)與之相關(guān)的靶向miRNA。根據(jù)這些差異表達(dá)circRNA、靶向miRNA以及miRNA靶基因的表達(dá)模式，共篩選出5個(gè)與小麥干旱脅迫相關(guān)的潛在circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控模塊。

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Identification of wheat circular RNAs responsive to drought stress

LI Ning, LIU Kun, LIU TongTong, SHI YuGang, WANG ShuGuang, YANG JinWen, SUN DaiZhen

College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】Drought is one of the foremost abiotic stress limiting global wheat production. Exploring the molecular mechanism of wheat response to drought stress have great significance in wheat molecular breeding. Circular RNAs (circRNAs) have been proved to play an important role in the process of plants tolerance to environmental stresses. Therefore, identifying circRNAs involved in drought stress response will help to construct a regulatory network of wheat drought tolerance, and lay a foundation for analyzing the drought resistance mechanism in wheat. 【Method】In this study, two wheat varieties (Zhoumai13 and Jimai38) with significant differences in drought resistance were used and circRNA-seq was performed on their root samples under well-watered and drought conditions. Differentially expressed circRNAs related to drought stress response were screened based on the identified circRNAs and their microRNAs (miRNAs) targets were predicted. Further, potential circRNA-miRNA-mRNA regulatory modules related to wheat drought stress response were constructed according to the expression patterns of miRNAs and their target genes under drought stress. 【Result】A total of 1 409 wheat circRNAs were identified, most of which (68.91%) were exonic circRNAs. Only 133 circRNAs were simultaneously identified in both varieties. A total of 239 differentially expressed circRNAs were identified under drought stress, of which 138 circRNAs were specifically differentially expressed in the drought-resistant variety Zhoumai 13 (ZM13), and 19 circRNAs were differentially expressed simultaneously in both varieties. Besides, 34 targeted miRNAs and 1 408 miRNA target genes were predicted. Based on the expression patterns of these differentially expressed circRNAs, targeted miRNAs, and miRNA target genes, five potential circRNA-miRNA-mRNA regulatory modules centered on tae-miR9664-3p, tae-miR1122b-3p, tae-miR9662a-3p, tae-miR6197-5p and tae-miR1120c-5p in response to drought stress were screened. 【Conclusion】Wheat circRNAs have obvious specificity in different cultivars and different expression patterns among different drought-tolerant wheat cultivars. A total of 239 wheat circRNAs and 5 potential circRNA-miRNA-mRNA regulatory modules in response to drought stress were identified in the present study.

wheat; circular RNAs; drought stress; microRNAs

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.23.002

2022-07-25；

2022-09-05

山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（20210302124148）、山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2021L124）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（2020BQ30）

李寧，E-mail：13159862006@163.cm。通信作者楊進(jìn)文，E-mail：yang_jin_wen@126.com。通信作者孫黛珍，E-mail：sdz64@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）