李志玲，李香菊，崔海蘭，于海燕，陳景超

牛筋草EPSPS酶聯(lián)免疫試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用

李志玲，李香菊，崔海蘭，于海燕，陳景超

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

克隆牛筋草（）中草甘膦的靶標(biāo)基因，獲得牛筋草EPSPS重組蛋白并制備其單克隆及多克隆抗體，組裝酶聯(lián)免疫試劑盒，檢測牛筋草植株不同組織的表達(dá)水平及蛋白含量，為快速鑒定抗性牛筋草提供簡便工具。利用PCR方法克隆基因全長；構(gòu)建pET30a-EPSPS陽性質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組蛋白；利用該重組蛋白免疫小鼠與新西蘭大白兔，制備單克隆及多克隆抗體，并利用Western blot檢測特異性；利用間接ELISA方法進(jìn)行免疫配對試驗(yàn)，篩選出最佳配對抗體，優(yōu)選各試劑工作濃度并組裝試劑盒；用研制的試劑盒對不同種群牛筋草進(jìn)行EPSPS含量檢測，并與qPCR結(jié)果分析比較。牛筋草的開放閱讀框含有1 620 bp的核苷酸，編碼540個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.80，該蛋白無跨膜區(qū)域。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明牛筋草EPSPS與水稻EPSPS進(jìn)化關(guān)系最近。誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的培養(yǎng)條件為1 mmol·L-1的IPTG，25℃，獲得了純度大于90%，濃度為3 mg·mL-1的重組蛋白12 mg；編號為R1711和R1712的家兔免疫后產(chǎn)生的多克隆抗體有較高的效價(jià)，編號為M171070、M171071、M171072的小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體效價(jià)較高。進(jìn)一步篩選出單抗FL-374-08能與多克隆抗體組成最佳配對抗體；酶聯(lián)免疫試劑盒包被抗體的最優(yōu)質(zhì)量工作濃度為2 μg·mL-1，酶標(biāo)抗體的最優(yōu)工作濃度為10 μg·mL-1；試劑盒線性檢測范圍為5—80 μg·kg-1，檢出限為5 μg·kg-1?？剐耘＝畈葜仓耆~片中的表達(dá)量是敏感植株的52.9倍，而莖中的表達(dá)量是敏感植株的63.0倍。在抗性牛筋草葉片中相對拷貝數(shù)是敏感植株的53.5倍，而莖中的相對拷貝數(shù)是敏感植株的78.6倍。Western blot結(jié)果表明單抗與牛筋草EPSPS有特異性免疫，并能準(zhǔn)確區(qū)分不同敏感性植株及不同組織的蛋白含量差異。酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗性牛筋草莖中的EPSPS濃度可以達(dá)到6.0 μg·L-1，而敏感植株葉片和莖中EPSPS蛋白的濃度分別為0.22和0.43 μg·L-1。獲得的牛筋草EPSPS單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高，研發(fā)的EPSPS酶聯(lián)免疫試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確檢測牛筋草EPSPS蛋白含量并鑒定牛筋草由過量表達(dá)導(dǎo)致的草甘膦抗藥性。

牛筋草；草甘膦；抗體；抗藥性；快速檢測；ELISA

0 引言

【研究意義】牛筋草（）為禾本科穇屬一年生雜草，是全球“十大”惡性雜草之一[1]。牛筋草具有很強(qiáng)的適應(yīng)力和繁殖能力，多生于農(nóng)田、果園和路旁，分布于全世界溫帶和熱帶地區(qū)，在我國主要分布于黃河流域及以南的廣泛區(qū)域[2-3]。草甘膦（glyphosate）是一種非選擇性除草劑，具有高效、低毒、低殘留等特點(diǎn)，常用于非耕地及部分作物田的保護(hù)性噴霧。草甘膦在我國有近50年的應(yīng)用歷史，長期應(yīng)用使得牛筋草對其抗性問題日益突出，特別是在我國廣東、廣西地區(qū)的果園、菜園等作物田，此外，我國的直播稻田、棉田、茶園等也發(fā)現(xiàn)抗草甘膦的牛筋草種群[4]?？共莞熟⑴＝畈莸漠a(chǎn)生增加了防控成本，降低了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。研究抗性牛筋草快速、簡易的檢測方法，在生長初期合理選藥，是有效防控牛筋草的重要技術(shù)手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物莽草酸途徑的重要酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）是草甘膦的作用靶標(biāo)。草甘膦與該酶的催化底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）結(jié)構(gòu)相似，可抑制EPSPS的活性，阻斷莽草酸途徑，干擾芳香族氨基酸的合成，最終導(dǎo)致植物死亡[5]。雜草對草甘膦的抗性分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性。靶標(biāo)抗性通常是指靶標(biāo)基因的突變或靶標(biāo)蛋白的過量合成，導(dǎo)致雜草對除草劑的敏感性下降。非靶標(biāo)抗性是指雜草體內(nèi)對除草劑的吸收傳導(dǎo)或代謝方式發(fā)生改變，使除草劑不能正常發(fā)揮作用[6-7]?？剐缘姆肿訖z測方法主要針對靶標(biāo)抗性機(jī)制，包括序列保守位點(diǎn)PCR檢測、表達(dá)量qPCR檢測、EPSPS蛋白免疫印跡檢測等，以上方法對場地、儀器、技術(shù)人員的要求較高，樣本處理復(fù)雜，成本較高。酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）利用抗原、抗體特異性結(jié)合原理，快速對檢測樣品定性、定量。由于該方法的簡便、快速和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已應(yīng)用于不同類型蛋白的檢測[8-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，抗草甘膦雜草檢測方法主要依賴整株植株測定法、PCR及qPCR等分子檢測方法[13]，這些方法或需要較長時(shí)間，或操作難度高費(fèi)用昂貴，很難應(yīng)用于基層快速檢測。的過量表達(dá)是牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性的常見靶標(biāo)抗性機(jī)制[14]，利用ELISA定量檢測蛋白含量可快速、簡便鑒定牛筋草對草甘膦的抗性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過制備牛筋草EPSPS蛋白的單克隆、多克隆抗體，利用Western blot和ELISA方法對靶標(biāo)蛋白定性、定量分析，檢測不同抗性水平牛筋草、不同組織的靶標(biāo)蛋白含量，建立一種快速對牛筋草EPSPS蛋白定性、定量的方法，為鑒別抗草甘膦牛筋草提供有力工具。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年5月至2022年6月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

供試種子：抗性種群采自四川省成都市雙流縣，敏感種群采自抗性種群附近未施用過草甘膦的荒地。

供試試劑：BL21（DE3）感受態(tài)（北京博邁德基因技術(shù)有限公司），骨髓瘤細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室保存），Ni樹脂（生工生物工程（上海）股份有限公司），蛋白定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司），小牛血清及胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 EPSPS序列的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室對牛筋草轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物克隆。從NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）搜索并下載不同植物EPSPS蛋白序列。利用軟件MEGA7.0.14進(jìn)行多序列對比，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，并1 000次重復(fù)構(gòu)建[15]。

1.3 EPSPS原核表達(dá)及純化

根據(jù)牛筋草EPSPS蛋白序列，優(yōu)化密碼子合成核苷酸序列（生工生物工程（上海）股份有限公司）并構(gòu)建pET30a表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）后涂板培養(yǎng)，挑取pET30a-EPSPS單克隆菌落接入LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素濃度50 μg·mL-1），37℃培養(yǎng)至OD=0.4—0.6，加入濃度為1 mmol·L-1的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，離心收集菌體；加入破碎液進(jìn)行超聲波裂解，收集上清和沉淀；收集的上清利用高親和性Ni樹脂進(jìn)行純化，收集流穿液、洗脫液。SDS-PAGE檢測純化效果。

1.4 EPSPS多克隆抗體的制備

1.4.1 免疫原制備 將表達(dá)純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑混合乳化均勻，免疫2只新西蘭大白兔，皮下免疫3次，間隔4周。

1.4.2 多克隆抗體純化 兔血清室溫離心15 min，取上清，4℃攪拌緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌、離心棄上清；將沉淀溶于適量PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4），4℃攪拌緩慢加入飽和硫酸銨至33%，繼續(xù)攪拌、離心，棄上清；將沉淀溶于適量PBS，4℃透析過夜，-20℃凍存?zhèn)溆?。使用Protein A小柱進(jìn)行純化，先用超純水過柱，再用PB緩沖液（0.4 mol·L-1，pH 7.0）平衡純化小柱；使用甘氨酸-鹽酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 3.0）洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并加入1 mol·L-1Tris-HCl，調(diào)節(jié)pH以保存抗體。

1.4.3 間接ELISA檢測 用碳酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 9.6）稀釋純化的蛋白至1 μg·mL-1，加入96孔酶標(biāo)板（100 μL/孔），37℃反應(yīng)3 h或4℃靜置過夜；甩去液體，加入250 μL洗滌液，靜置30 s，重復(fù)3次；加入檢測樣本（100 μL/孔），同時(shí)設(shè)置陽性對照（免疫后兔血清）、陰性對照（免疫前兔血清）和空白對照（不加兔血清），37℃反應(yīng)45 min；洗滌、靜置、晾干重復(fù)3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗（100 μL/孔），37℃孵育45 min；洗滌、靜置、晾干重復(fù)3次；加入顯色劑（100 μL/孔），室溫避光孵育15 min；加入終止液（100 μL/孔），使用酶標(biāo)儀在波長450 nm下讀取OD值。

1.5 EPSPS單克隆抗體的制備

1.5.1 制備小鼠脾臟細(xì)胞、細(xì)胞融合及擴(kuò)大培養(yǎng) 將純化的蛋白與等體積的弗氏佐劑混合乳化均勻，免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，間隔4周。加強(qiáng)免疫后犧牲小鼠，70%乙醇浸泡消毒，取出脾臟，磨碎，過80目篩網(wǎng)，得到脾細(xì)胞。在PEG4000的作用下，將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。將融合好的細(xì)胞鋪進(jìn)96孔板，用HAT培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后改用HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。10 d后，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清；使用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化并檢測，將陽性克隆繼續(xù)克隆化，直到得到的克隆均為陽性，建立陽性細(xì)胞株。最終獲得5株陽性細(xì)胞株，將其擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行凍存。

1.5.2 制備腹水 提前一周在Balb/c小鼠腹腔內(nèi)注射礦物油，將1×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞注射入小鼠腹腔，10 d后收集腹水，離心，上清即為單克隆抗體腹水。

1.5.3 單克隆抗體純化 腹水室溫離心15 min，取上清，4℃攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨至半飽和，攪拌、離心（13 000 r/min，4℃），棄上清；沉淀溶于適量PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4），4℃下攪拌逐滴加入飽和硫酸銨至33%，攪拌、離心30 min，棄上清；將沉淀溶于適量PBS，4℃透析過夜后，-20℃凍存?zhèn)溆?。采用Protein G小柱進(jìn)行純化，先用超純水過柱，再用PB緩沖液（0.4 mol·L-1，pH 7.0）平衡純化小柱，使用甘氨酸-鹽酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 2.7）洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并加入1 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）中和甘氨酸，使pH保持抗體保存的中性條件。

1.5.4 抗體篩選 采用間接ELISA方法對純化后的抗體進(jìn)行效價(jià)檢測；用小鼠對抗體進(jìn)行亞型檢測；利用雙抗夾心ELISA方法對制備的抗體進(jìn)行篩選，篩選出可配對的抗體對，具體方法：用CB（0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）稀釋包被抗體至10 μg·mL-1，每孔100 μL，37℃包被3 h。洗板，拍干，加入陽性標(biāo)品/陰性對照/陽性樣本/陰性樣本，25℃下反應(yīng)45 min。洗板，拍干，加入酶標(biāo)抗體，每孔100 μL，25℃反應(yīng)45 min，洗板，拍干，加入顯色劑，25℃避光反應(yīng)15 min。加入100 μL終止液，讀取OD值。

1.6 ELISA試劑盒的研發(fā)

1.6.1 緩沖液的配制 包被緩沖液CB（0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）；樣品提取液PBS（0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）；洗滌液（含0.2%吐溫-20的PBS）；封液閉（含1% BSA的CB）；終止液（2 mol·L-1H2SO4）。

1.6.2 酶標(biāo)板的制備 取一定量EPSPS單克隆抗體于包被液中，配置濃度約為2 μg·mL-1的包被工作液。將包被工作液（100 μL/孔）加入酶標(biāo)板微孔，4℃靜置過夜；在CB緩沖液中加入一定量的BSA、水楊酸鈉和蔗糖，使BSA、水楊酸鈉、蔗糖的濃度分別為1%、0.05%、5%，配置成封閉工作液；酶標(biāo)板用洗板機(jī)吸干-洗滌兩次；將封閉工作液按每孔150 μL加入微孔，37℃烘焙3 h。洗板、拍干，將酶標(biāo)板放入冷凍真空干燥機(jī)抽干3 h，真空熱封。

1.6.3 EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉的制備 大腸桿菌（）中原核表達(dá)并通過親和純化的EPSPS重組蛋白（C端帶有6個(gè)His標(biāo)簽），母液濃度為3 mg·mL-1，稀釋到16 ng·mL-1。棕色玻璃瓶加入100 μL的16 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品，冷凍干燥機(jī)過夜抽干得到標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉。

1.6.4 酶標(biāo)記抗體工作液的配置 取純化的EPSPS多克隆抗體，與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)為酶標(biāo)記抗體，取一定量的酶標(biāo)記抗體加入樣品提取液中，充分混勻，使其終濃度為2 μg·mL-1，2—8℃避光保存。HRP標(biāo)記的EPSPS多克隆抗體的具體制備方法：將HRP溶于純水，加入高碘酸鈉，室溫反應(yīng)30 min；將等量抗體用偶聯(lián)緩沖液透析過夜；HRP加入抗體溶液中，室溫反應(yīng)2 h，加入硼氫化鈉封閉反應(yīng)位點(diǎn)，磷酸鹽緩沖液透析過夜，加入等量甘油保存于-20℃。

1.7 抗草甘膦牛筋草EPSPS表達(dá)、拷貝數(shù)及蛋白含量檢測

1.7.1 qPCR檢測牛筋草表達(dá)量及拷貝數(shù) 選取敏感與抗性的牛筋草植株作為試驗(yàn)樣品，取新鮮葉片、莖在液氮下研磨充分，分別提取組織的DNA、RNA并反轉(zhuǎn)錄，使用作為內(nèi)參基因，選用專用的引物對（表1），采用qPCR的方法讀取不同植株、不同組織的Ct值，處理數(shù)據(jù)得到的相對表達(dá)量和拷貝數(shù)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法[16]。Ct=-[(Ct,-Ct,)處理- (Ct,-Ct,)對照][17]。

表1 本研究所用引物序列

1.7.2 Western blot檢測牛筋草EPSPS表達(dá)量 提取抗性與敏感植株不同組織的總蛋白，將純化的EPSPS蛋白與Loading buffer充分混勻、煮沸，進(jìn)入SDS-PAGE，以制備的單克隆抗體為一抗，采用Western blot檢測目的蛋白與單抗、多抗的免疫特異性。

1.7.3 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測EPSPS含量 用2 mL樣品提取液溶解EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品，此溶液濃度為32 μg·L-1，梯度稀釋EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品，制成16、8、4、2、1 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液；取0.1 g液氮研磨的牛筋草葉片、莖稈樣本，加入1 mL樣品提取液，振蕩混勻離心取上清；將100 μL空白對照/標(biāo)準(zhǔn)品/待測樣品對應(yīng)的上清加入微孔，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45 min；將孔內(nèi)液體甩干、洗滌、拍干，重復(fù)3次；加入抗體工作液（100 μL/孔），輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育30 min；加入酶標(biāo)抗體（100 μL/孔），振蕩混勻，25℃避光反應(yīng)45 min；加入顯色劑（100 μL/孔），置于25℃避光反應(yīng)15 min；加入終止液（100 μL/孔），輕輕振蕩混勻；酶標(biāo)儀設(shè)定至450 nm，測定每孔OD值。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)繪圖軟件，根據(jù)所測定的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測樣品的OD值即可計(jì)算出未知樣品中EPSPS的濃度。

2 結(jié)果

2.1 EPSPS序列的克隆與進(jìn)化樹分析

利用前期轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物克隆，序列分析結(jié)果表明，牛筋草的開放閱讀框含有1 620 bp的核苷酸，編碼540個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.80，該蛋白無跨膜區(qū)域（圖1）。利用MEGA7.0.14軟件比對10種EPSPS蛋白序列，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析表明，牛筋草EPSPS蛋白與水稻EPSPS親緣關(guān)系最近（圖2）。

2.2 EPSPS原核表達(dá)及蛋白純化

將構(gòu)建的pET30a-EPSPS陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，搖菌培養(yǎng)后，在一定條件下進(jìn)行蛋白表達(dá)誘導(dǎo)。SDS-PAGE檢測結(jié)果（圖3）顯示，有明顯的目的蛋白產(chǎn)生且主要以可溶形式存在，經(jīng)檢測，最終目的蛋白純度大于90%，濃度3 mg·mL-1，蛋白量12 mg。這表明，含有陽性質(zhì)粒的宿主菌BL21在IPTG濃度1 mmol·L-1，溫度25℃的條件下誘導(dǎo)6 h，可以有效表達(dá)目的蛋白。同時(shí)，在Ni樹脂純化蛋白過程中，結(jié)果顯示使用200 mmol·L-1咪唑洗脫時(shí)蛋白純度最佳。

2.3 多克隆抗體的純化及效價(jià)檢測

以純化EPSPS蛋白為抗原，制備的多克隆抗體（檢測樣本）為一抗，同時(shí)，設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照，加入HRP標(biāo)記的羊抗酶標(biāo)二抗，對多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)檢測。由表2可見，編號為R1711和R1712的家兔免疫后產(chǎn)生的多克隆抗體有較高的效價(jià)，可用于下一步試驗(yàn)。

2.4 EPSPS單克隆抗體的制備

免疫4周后，對4只小鼠產(chǎn)生的抗體間接ELISA檢測，由表3可見，編號M171070、M171071、M171072的小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體效價(jià)較高，為1﹕243K。將取得的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選后得到5株陽性克隆株。將細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)表達(dá)抗體，收集腹水，經(jīng)純化、洗脫，采用雙抗夾心ELISA方法對純化后的單克隆抗體（FL-374-01—35）進(jìn)行效價(jià)檢測，由表4可知，大部分純化后的單克隆抗體效價(jià)均＞1﹕1 024K。以多克隆抗體為酶標(biāo)抗體，加入重組蛋白/陰性對照/陽性樣本/陰性樣本，對編號FL-374-01—35（表4）抗體進(jìn)行免疫配對試驗(yàn)。當(dāng)FL-374-08為包被抗體時(shí)，重組蛋白的OD值最高，表明此抗體與多克隆抗體的配對效果最好，因此采用FL-374-08（由保藏編號為CGMCC No.22308的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生）與兔多抗來制備酶聯(lián)免疫試劑盒。此外，用小鼠抗體亞型檢測試劑盒對抗體進(jìn)行亞型檢測，結(jié)果均為IgG類抗體。

表2 多克隆抗體效價(jià)檢測

圖1 牛筋草EPSPS序列的克隆及分析

圖2 牛筋草EPSPS序列的進(jìn)化樹分析

表3 單克隆抗體效價(jià)檢測

圖3 SDS-PAGE檢測EPSPS蛋白的透析結(jié)果

2.5 ELISA試劑盒的組裝

經(jīng)驗(yàn)證和優(yōu)化，將試劑盒檢測體系建立如下：以0.1 mol·L-1、pH 9.6碳酸鹽緩沖液（CB）為包被緩沖液，稀釋EPSPS單克隆抗體至2 μg·mL-1，加入96孔酶標(biāo)板靜置過夜。使用洗滌劑（0.2%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液）洗滌酶標(biāo)板，CB溶液與一定量的BSA、水楊酸鈉和蔗糖配置封閉工作液，每孔150 μL加入微孔，于37℃封閉3 h。以0.01 mol·L-1、pH 7.4磷酸鹽緩沖液為樣品提取液溶解EPSPS蛋白樣品，每孔100 μL加入微孔，25℃避光孵育45 min，洗板3次；將多克隆抗體與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)，得到酶標(biāo)記抗體，每孔100 μL，25℃避光孵育45 min；每孔加入100 μL顯色劑，25℃避光孵育15 min；以2 mol·L-1H2SO4溶液或1 mol·L-1HCl溶液作為終止液，每孔加入100 μL，振蕩終止反應(yīng)（表5）。

牛筋草EPSPS蛋白單克隆抗體為包被抗體，濃度為1.8—2.2 μg·mL-1。制備的EPSPS多克隆抗體作為酶標(biāo)記抗體，其濃度為8—12 μg·mL-1。使用樣品提取液溶解EPSPS蛋白樣品，制成16、8、4、2、1 μg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性檢測范圍為5—80 μg·kg-1，檢出限為5 μg·kg-1。

2.6 qPCR檢測不同植株EPSPS表達(dá)量和拷貝數(shù)

通過qPCR檢測表達(dá)量結(jié)果的比較，對研發(fā)設(shè)計(jì)的試劑盒進(jìn)行敏感性和特異性評估。敏感和抗性種群每個(gè)種群中至少選取4株，提取不同組織（葉、莖）的RNA，qPCR分析靶標(biāo)基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性植株的葉片中的表達(dá)量是敏感植株的52.9倍，抗性植株莖中的表達(dá)量是敏感植株的63.0倍（圖4）。在抗性與敏感牛筋草植株莖中的表達(dá)量均高于葉片中。取相同植株的DNA進(jìn)行相對拷貝數(shù)的檢測，發(fā)現(xiàn)在抗性植株的葉片中相對拷貝數(shù)是敏感植株的53.5倍，在莖中是敏感植株的78.6倍（圖5）。

2.7 Western blot檢測不同植株EPSPS蛋白

Western blot可以實(shí)現(xiàn)對蛋白含量的半定量檢測，用制備的牛筋草EPSPS單克隆抗體，利用蛋白免疫印跡法對抗性與敏感植株的不同組織進(jìn)行蛋白表達(dá)量的檢測。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)制備的單克隆抗體特異性強(qiáng)，無明顯的非特異性條帶。該抗體的敏感性高，能鑒定出敏感種群中EPSPS蛋白?？剐灾仓甑娜~片與莖中EPSPS蛋白的含量明顯高于敏感植株的相應(yīng)組織，EPSPS蛋白在敏感植株葉片中的含量略低于在莖中的含量，抗性植株葉片的EPSPS蛋白含量與莖的EPSPS蛋白含量相當(dāng)（圖6）。Western blot結(jié)果表明EPSPS單克隆抗體的特異性強(qiáng)、靈敏度高。

圖4 抗性與敏感牛筋草植株不同組織的EPSPS表達(dá)量

表4 單抗與多抗的配對效果

圖5 抗性與敏感牛筋草植株不同組織的EPSPS相對拷貝數(shù)

表5 ELISA試劑盒的組成

1、2：莖-敏感Stem-sensitive；3、4：莖-抗性Stem-resistant；5—7：葉-敏感Leaf-sensitive；8：葉-抗性Leaf-resistant

2.8 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測不同植株EPSPS蛋白

以EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）。將樣本的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，讀出樣本對應(yīng)的濃度，便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。與Western blot檢測的結(jié)果類似，酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPSPS蛋白在抗性牛筋草葉片與莖中的含量顯著高于敏感植株，在莖中的濃度可以達(dá)到6.0 μg·L-1，而敏感植株葉片和莖中EPSPS蛋白的濃度分別為0.22和0.43 μg·L-1（圖8）。使用研發(fā)的試劑盒和方法能夠鑒定牛筋草樣品對草甘膦是否產(chǎn)生抗性。

圖7 EPSPS酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

圖8 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測抗性與敏感牛筋草植株不同組織的EPSPS蛋白濃度

3 討論

3.1 EPSPS的克隆與分析

莽草酸途徑是微生物和植物體內(nèi)的重要生物代謝途徑，EPSPS是植物莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，也是草甘膦的靶標(biāo)酶，在芳香族氨基酸合成過程中起著重要作用。草甘膦與磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的結(jié)構(gòu)相似，可與EPSPS競爭性結(jié)合，阻斷EPSP的合成，干擾植物生理生化反應(yīng)[18]。為方便研究雜草對草甘膦的抗性機(jī)制，為草甘膦抗性提供后備基因資源，目前，已在多種雜草和作物中被克隆和分析[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)牛筋草全長基因共3 106 bp，經(jīng)序列比對與水稻親緣關(guān)系最近，EPSPS蛋白全長562個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為8.80。

3.2 酶聯(lián)免疫試劑盒的相關(guān)參數(shù)

構(gòu)建原核表達(dá)載體對目的蛋白進(jìn)行異源表達(dá)是制備單克隆抗體抗原的常用方法，但誘導(dǎo)條件不盡相同[21-22]。本研究通過將轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得表達(dá)純化蛋白，誘導(dǎo)條件為IPTG濃度1 mmol·L-1，溫度25℃下誘導(dǎo)6 h。本研究采用間接酶聯(lián)免疫方法，以單抗為包被酶標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的多抗為酶標(biāo)抗體，特異性地對蛋白進(jìn)行定量分析。為確保單抗和多抗的質(zhì)量，在制備過程中以絕對純化的EPSPS蛋白為免疫原，并對純化前后的抗體進(jìn)行效價(jià)檢測。Western blot結(jié)果條帶單一清晰，可驗(yàn)證制備的多抗和單抗與純化后的EPSPS蛋白具有特異性。在單克隆抗體篩選過程中，以純化的單抗為包被酶標(biāo)抗體，使用HRP標(biāo)記高質(zhì)量多克隆抗體以此作為酶標(biāo)二抗，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法，篩選出匹配程度較高的單抗、多抗組合作為試劑盒的關(guān)鍵試劑。經(jīng)過濃度條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定，確定了試劑盒所需試劑的具體濃度及樣品的線性檢測范圍。

3.3 酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用分析

本研究發(fā)現(xiàn)，抗性與敏感牛筋草植株葉片中的表達(dá)量要低于莖中，這與田旋花及黃瓜上檢測到的的表達(dá)結(jié)果不同，這兩種植物的表達(dá)量均為葉片中顯著高于莖中[23-24]。有研究證實(shí)，的過量表達(dá)與該基因在染色體上的拷貝數(shù)增加相關(guān)，也可能與該基因的啟動(dòng)子序列發(fā)生缺失有關(guān)[25-26]。在本試驗(yàn)中，抗草甘膦牛筋草的抗性機(jī)制是過量表達(dá)，引起EPSPS蛋白大量積累。經(jīng)該試劑盒對EPSPS蛋白的含量測定可準(zhǔn)確辨別由過量表達(dá)引起的抗性雜草。現(xiàn)有研究表明，在同一牛筋草種群中基因突變（P106S、P106A）和過量表達(dá)共同導(dǎo)致了牛筋草抗性的產(chǎn)生[14,27]。只存在基因突變這一種抗性機(jī)制的牛筋草，其相對表達(dá)量和拷貝數(shù)與敏感型牛筋草情況基本一致。該試劑盒不能夠檢測基因突變引起的草甘膦抗性，更不能明確牛筋草的抗性水平。在本試驗(yàn)中，未對兩種抗性機(jī)制共同作用的牛筋草進(jìn)行試劑盒檢驗(yàn)，適用性還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

在雜草生長初期快速鑒定除草劑抗性，可以根據(jù)檢測結(jié)果制定經(jīng)濟(jì)有效的除草策略[28-30]。雜草抗藥性檢測作為抗性治理的重要環(huán)節(jié)，檢測方法也在不斷地深入研究和完善?，F(xiàn)有整株水平測定法、器官或組織生物測定法、細(xì)胞或細(xì)胞器水平檢測方法、生理生化鑒定法、分子水平檢測法等重要的檢測方法。整株水平測定法是應(yīng)用最廣泛的檢測方法，該方法簡單易行、準(zhǔn)確性高，但時(shí)間周期長。其余幾種可根據(jù)雜草的實(shí)際情況具體選擇，或結(jié)合幾種方法同時(shí)使用，提高準(zhǔn)確性。分子水平的ELISA法在雜草抗性檢測中不常使用，主要因?yàn)殡s草抗藥性關(guān)鍵酶的確定及其單抗的制備[31]?？共莞熟㈦s草的檢測方法除了整株生物測定法，還有莽草酸含量檢測法、EPSPS檢測法、葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法、DNA分析法及RT-qPCR法。此次研發(fā)的試劑盒運(yùn)用ELISA方法制備EPSPS的專一性單克隆抗體，可快速、靈敏、簡便地檢測雜草的草甘膦抗性。對儀器要求簡單、操作方便的檢測方法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)一線更具有應(yīng)用價(jià)值[32]。該試劑盒也具有一定的局限性，只能夠檢測由于靶標(biāo)基因過量表達(dá)引起的草甘膦抗性，由于不同雜草的基因序列相似度較高，該試劑盒有檢測不同雜草的潛在價(jià)值。

4 結(jié)論

獲得的牛筋草EPSPS蛋白的單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、效價(jià)高的優(yōu)點(diǎn)，研發(fā)的酶聯(lián)免疫試劑盒可精準(zhǔn)定量檢測牛筋草植株中EPSPS蛋白的含量，為抗草甘膦牛筋草的快速鑒定提供了有力工具。

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Development and application of ELISA kit for detection of EPSPS in

LI Zhiling, LI Xiangju, CUI Hailan, YU Haiyan, CHEN Jingchao

State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

The objective of this study is to clone the target geneof glyphosate in, obtain the recombinant protein and antibody against EPSPS protein, then assemble the EPSPS ELSIA kit, finally, to detect theexpression and protein content of different plants and tissues of, and to provide a powerful tool for rapid identification of glyphosate resistantindividuals.The full-length ofwas cloned by PCR method. The constructed pET30a-EPSPS positive plasmid was transformed into host bacteria BL21, which was induced by IPTG to express and purify the protein. Monoclonal and polyclonal antibodies were prepared by immunizing mice and New Zealand white rabbits with EPSPS recombinant protein as immunogen, and the specificity of the antibodies was detected by Western blot. Best matching antibody was screened by indirect ELISA. the working concentration of each reagent was optimized and the kit was assembled. The content of EPSPS in differentpopulations was detected by the assembled kit and compared with the results of qPCR.The open reading frame ofcontains 1 620 bp nucleotide and encodes 540 amino acids, with a theoretical isoelectric point of 8.80. The protein has no transmembrane region. The evolutionary tree analysis showed that the evolutionary relationship between EPSPS ofand EPSPS of rice was the closet. The protein could be expressed under a condition of 1 mmol·L-1IPTG, 25℃. After purification, the purity of prokaryotic expression protein was more than 90%, the concentration was 3 mg·mL-1, and the protein content was 12 mg. Polyclonal antibodies produced from rabbits numbered R1711 and R1712 showed higher potency. Monoclonal antibodies produced from mice numbered M171070, M171071 and M171072 showed higher potency. A group of optimal matching antibodies (FL-374-08 monoclonal antibody and polyclonal antibody) were screened. The optimal concentration of coated antibody was 2 μg·mL-1. The optimal concentration of enzyme-labeled antibody was 10 μg·mL-1. The linear detection range of Elisa kit was 5-80 μg·kg-1, and the detection limit was 5 μg·kg-1. The expression ofin leaf of resistant individuals was 52.9 times higher than that in the susceptible individuals. Similarly, it was 63.0 times higher in stem. In the resistance individuals, the relative copy number ofin leaf was 53.5 times higher than that in the susceptible individuals, and it was 78.6 times higher in stem. Western blot results showed that monoclonal antibodies had specific immunity to EPSPS and could accurately distinguish the difference of protein content in different plants and tissues. The concentration of EPSPS in stem of resistant individuals was 6.0 μg·L-1, while, it was only 0.22-0.43 μg·L-1in susceptible individuals, which detected by Elisa kit.The monoclonal antibody of EPSPS obtained in this study showed higher specificity, and sensitivity. The Elisa kit can be used to quickly and accurately identify glyphosate resistance inwhich caused byoverexpression.

; glyphosate; antibody; resistance; rapid detection; ELISA

2022-07-18；

2022-09-03

北京市自然科學(xué)基金（6222051）

李志玲，E-mail：82101215278@caas.cn。通信作者陳景超，E-mail：chenjingchao@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）