蔣琪琪，許建建，蘇越，張琦，曹鵬，宋晨虎，李中安，宋震

柑橘黃化花葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及應(yīng)用

蔣琪琪，許建建，蘇越，張琦，曹鵬，宋晨虎，李中安，宋震

西南大學(xué)柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712

構(gòu)建柑橘黃化花葉病毒（citrus yellow mosaic virus，CYMV）侵染性克隆，為深入研究其分子特性及致病機(jī)理打下基礎(chǔ)。利用In-Fusion同源重組技術(shù)將分段擴(kuò)增的CYMV基因組序列與三元表達(dá)載體pCY重組連接，構(gòu)建該病毒1.4倍基因組全長DNA克隆并開展序列分析。將所獲克隆通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種尤力克檸檬實(shí)生苗，通過分子檢測、癥狀和病毒粒子觀察及再嫁接實(shí)驗(yàn)鑒定其侵染性。利用所獲侵染性克隆接種不同的柑橘品種及草本植物，通過RT-PCR檢測確定侵染率，觀察不同柑橘品種受侵染后的癥狀差異?；谇秩拘钥寺?gòu)建ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein，）的突變體，分析突變對(duì)病毒侵染性的影響。利用In-Fusion同源重組技術(shù)獲得CYMV 1.4倍基因組全長DNA克隆7個(gè)。其中，CYMV-3與已登錄GenBank的9個(gè)CYMV分離株基因組相應(yīng)核苷酸序列一致性為90%—100%，與分離株CYMV-SO（AF347695）同源性最高并在遺傳進(jìn)化樹上聚為一簇。侵染性鑒定結(jié)果表明，CYMV-3接種的14株尤力克檸檬植株中有4株呈RT-PCR陽性，并觀察到點(diǎn)狀褪綠癥狀；提取侵染植株系統(tǒng)新葉DNA，PCR擴(kuò)增獲得預(yù)期的覆蓋CYMV基因組全長的特異性片段；以CYMV-3侵染顯癥植株為毒源嫁接接種粗檸檬實(shí)生苗，通過RT-PCR在90 dpi可檢測到CYMV特異性條帶；取CYMV-3侵染顯癥植株的新葉進(jìn)行固定切片并電鏡觀察，可見大小約130 nm×30 nm的桿狀病毒粒子，說明CYMV-3為CYMV侵染性克隆。將CYMV-3通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空浸潤接種10個(gè)柑橘品種，注射接種5個(gè)柑橘品種并進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示前者侵染率為11.11%—100.00%，后者侵染率為63.16%—90.00%，部分柑橘品種出現(xiàn)黃化、花葉、斑塊狀黃化等CYMV侵染癥狀。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種本氏煙、玉米、豇豆和高粱，結(jié)果顯示僅高粱檢測到RT-PCR陽性植株，且系統(tǒng)葉片沿葉脈周邊出現(xiàn)條狀褪綠帶，表明CYMV可以侵染高粱。構(gòu)建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的突變體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種粗檸檬，RT-PCR檢測結(jié)果均為陰性，且無侵染癥狀。成功構(gòu)建了CYMV的侵染性克隆，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射可高效接種柑橘植株，侵染癥狀在不同品種上具有差異。

柑橘黃化花葉病毒；侵染性克?。晦r(nóng)桿菌介導(dǎo)接種；突變體

0 引言

【研究意義】柑橘黃化花葉病毒（，CYMV）是逆轉(zhuǎn)錄病毒目（），花椰菜花葉病毒科（），桿狀DNA病毒屬（）的一種雙鏈DNA病毒[1-2]。該病毒侵染的典型癥狀是葉片呈黃色馬賽克，沿葉脈呈黃色斑點(diǎn)，造成染病植株的產(chǎn)量顯著減少和果實(shí)品質(zhì)的嚴(yán)重下降[3-6]。CYMV自1975年首次在印度安得拉邦阿南塔普爾地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，已擴(kuò)散至印度南部和中部種植區(qū)域，對(duì)其柑橘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，并存在進(jìn)一步擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[7]。目前，CYMV已被新西蘭、美國、日本和歐盟等國家和地區(qū)列入檢疫對(duì)象，歐洲食品安全局將其列為對(duì)歐盟植物健康最重要的30種威脅之一[8-9]。國內(nèi)還未見CYMV的報(bào)道，明確CYMV的分子生物學(xué)等特性對(duì)防范CYMV入侵、維護(hù)我國柑橘產(chǎn)業(yè)安全具有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CYMV具有典型的桿狀DNA病毒特征，大小約130 nm×30 nm，基因組約7.6 kb[4]，含有6個(gè)ORF，其中ORFⅠ編碼病毒粒子相關(guān)蛋白（virion-associated protein，VAP），ORFⅢ與ORFⅡ有4個(gè)堿基重疊，編碼一種多聚蛋白，翻譯后加工成MP、CP、AP、RT和RNaseH等[10]。ORFⅣ和ORFⅤ完全包含于ORFⅢ中，ORFⅥ部分包含于ORFⅢ中[1]。根據(jù)AHLAWAT等[11-15]分析預(yù)測，ORFⅣ可能是病毒核心復(fù)合體的一個(gè)單位；ORFⅤ可能與病毒基因轉(zhuǎn)錄的功能相關(guān)；ORFⅥ可能與膜定位的功能相關(guān)。除這些ORF外，還有一個(gè)約731 bp的IR，包含轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件[16]。侵染性克隆是將病毒全長基因組序列構(gòu)建在質(zhì)粒載體上，使其對(duì)寄主具有侵染活性[17]，近年來，病毒侵染性克隆已成為研究反向遺傳學(xué)、病毒生物學(xué)、病理學(xué)和病毒載體的有力工具，病毒侵染性克隆不僅是病毒病病原鑒定的基礎(chǔ)，也是病毒基因功能及其與寄主植物互作研究的重要前提[18-19]。【本研究切入點(diǎn)】CYMV具有通過帶病組織傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)，其部分開放閱讀框具體功能和致病機(jī)理尚不明確，因此構(gòu)建CYMV的基因組全長DNA克隆可為深入開展CYMV基因功能和成災(zāi)機(jī)制等研究打下基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建、鑒定CYMV侵染性克隆，通過ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的突變體構(gòu)建，探究ORFⅠ和ORFⅡ的功能。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年1月至2022年2月在西南大學(xué)柑桔研究所國家苗木脫毒中心實(shí)驗(yàn)室及隔離網(wǎng)室內(nèi)完成。

1.1 供試材料

CYMV毒源植株、三元表達(dá)載體pCY、基因沉默抑制子HC-Pro表達(dá)質(zhì)粒等均由西南大學(xué)柑桔研究所脫毒中心提供。

供試尤力克檸檬（）、W·默科特（）、馬水橘（）、3號(hào)椪柑（）、22號(hào)枳（）、哈姆林甜橙（）、玉環(huán)柚（）、晚白柚（）、金橙蜜柚（）、大果甜橙（）、威爾金柳葉橘（）、摩洛哥酸橙（）、粗檸檬（）、強(qiáng)德勒柚（）、鄧肯葡萄柚（）、MV甜橙（）和本氏煙（）均來自西南大學(xué)柑桔研究所脫毒中心。玉米（s）品種超越108購自重慶高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)種苗經(jīng)營部，豇豆（）品種白玉長豇、高粱（）品種佳牧5號(hào)購自山西佳年豐種業(yè)有限公司。

In-Fusion試劑盒、高保真酶Prime STAR? Max DNA Polymerase（R045Q）購自TaKaRa公司，NovoScript? Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）購自諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)CYMV全長基因組擴(kuò)增引物，詳細(xì)引物序列信息見表1。

1.3 CYMV侵染性克隆構(gòu)建

1.3.1 CYMV基因組全長分段擴(kuò)增 以CYMV感染植株的DNA為模板，使用引物CYMV-F5/R1擴(kuò)增0—292 bp區(qū)間A序列，CYMV-F2/R2擴(kuò)增293—4 511 bp區(qū)間B序列，CYMV-F3/R3擴(kuò)增4 512—7 559 bp區(qū)間C序列，CYMV-F4/R4重復(fù)擴(kuò)增4 857—20 bp區(qū)間D序列。擴(kuò)增體系：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL，混勻。PCR運(yùn)行程序：98℃，3 min；（98℃，10 s；60℃，15 s；72℃，30 s·kb-1）×35；72℃，5 min。

表1 CYMV侵染性克隆構(gòu)建及普通PCR檢測引物

小寫字母代表同源臂，斜體下劃線部分代表插入的酶切位點(diǎn)Ⅱ

The lowercase letters represent the homology arm, and the underlined parts in italics represent the inserted restriction sitesⅡ

1.3.2 pCY質(zhì)粒酶切 使用NEB限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ酶切pCY三元表達(dá)載體，獲得pCY線性載體，反應(yīng)體系：三元表達(dá)載體pCY質(zhì)粒1 μg（根據(jù)質(zhì)粒濃度計(jì)算），10×Cutsmart Buffer 5 μL，限制性內(nèi)切酶Ⅰ 1 μL、Ⅰ1 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：25℃，30 min；37℃，30 min；65℃，20 min終止反應(yīng)。

1.3.3 In-Fusion同源重組 將回收的1.4×CYMV基因組各片段分別與pCY線性化載體通過In-Fusion HD Cloning Kit連接，構(gòu)建策略如圖1所示，反應(yīng)體系：每個(gè)目的片段各0.75 μL，pCY線性化載體1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 1 μL。在PCR儀中50℃孵育30 min。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，挑選單克隆使用引物CYMV-JC-F2/R2菌檢，陽性克隆送擎科生物公司測序。

1.3.4 序列分析 利用DNAMAN 7.0對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對(duì)，使用MEGA X采用鄰接距離矩陣法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其與CYMV分離株及其他桿狀DNA病毒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.3.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種 參照CUI等[20-21]報(bào)道的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空浸潤接種柑橘，參照文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種柑橘及草本植株。

1.4 侵染性鑒定

提取植株系統(tǒng)葉總核酸，去除基因組DNA后參照文獻(xiàn)[7,24]進(jìn)行RT-PCR檢測；持續(xù)觀察接種植物癥狀，并對(duì)顯癥植株使用引物CYMV-1F/R和CYMV-2F/R分兩段擴(kuò)增CYMV基因組全長序列。以CYMV克隆侵染顯癥植株為毒源，通過嫁接接種健康粗檸檬，在接種90 d后（days post inoculation，dpi）提取系統(tǒng)新葉總核酸，進(jìn)行RT-PCR檢測，進(jìn)一步確認(rèn)克隆的侵染性。

1.5 病毒粒子的電鏡觀察

切取檢測為陽性植株的具有明顯癥狀的葉片側(cè)脈，成3 mm×1 mm長條形樣品，置于2.5%戊二醛中真空負(fù)壓固定2 h，送武漢邁斯普生物公司進(jìn)行病毒粒子觀察。

1.6 CYMV突變體構(gòu)建

使用Ⅰ和GⅠ雙酶切CYMV-3質(zhì)粒，回收目的大片段。參考1.3方法及表1引物擴(kuò)增相應(yīng)病毒片段及片段（均包含有15 bp相應(yīng)同源臂），進(jìn)而通過In-Fusion同源重組構(gòu)建ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的突變體CYMV 3-1、CYMV 3-2，并測序驗(yàn)證。

圖1 CYMV克隆構(gòu)建方案

2 結(jié)果

2.1 CYMV侵染性克隆構(gòu)建

2.1.1 CYMV基因組分段擴(kuò)增 利用引物CYMV- F4/R4、CYMV-F5/R1、CYMV-F2/R2和CYMV-F3/R3分段擴(kuò)增CYMV基因組特異片段（圖2），大小分別為2 724、292、4 219和3 048 bp，分別對(duì)應(yīng)環(huán)狀基因組4 857—20、0—292、293—4511和 4 512—7 559位核苷酸。所有片段大小均符合預(yù)期并覆蓋了1.4倍CYMV基因組全長。

2.1.2 同源重組大腸桿菌菌檢 將2.1.1所獲4個(gè)片段與線性化pCY載體片段分別切膠回收后混合，進(jìn)行In-Fusion重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。過夜培養(yǎng)挑取單克隆，使用引物CYMV-JCF2/R2進(jìn)行PCR檢測。檢測結(jié)果見圖3，共獲得7個(gè)單克隆，命名為CYMV-1—CYMV-7。

M：5000 bp marker；1、2：4857—20 bp區(qū)間序列片段4857-20 bp sequence fragment；3、4：0—292 bp區(qū)間序列片段0-292 bp sequence fragment；5、6：293—4511 bp區(qū)間序列片段293-4511 bp sequence fragment；7、8：4512—7559 bp區(qū)間序列片段4512-7559 bp sequence fragment

M：2000 bp marker；1—7：CYMV單克隆CYMV clones；8、9：陽性對(duì)照Positive control；10：陰性對(duì)照Negative control

2.1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空浸潤接種 將CYMV-1—CYMV-7轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空浸潤接種尤力克檸檬實(shí)生苗，并以空載體pCY為對(duì)照，提取系統(tǒng)新葉總核酸，去除基因組DNA后進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明，125 dpi時(shí)，CYMV-2和CYMV-3各自接種的14株尤力克檸檬中分別有3株和4株呈陽性，侵染率分別為21.43%和28.57%，其余克隆的接種植株均呈陰性；235 dpi的RT-PCR檢測結(jié)果與125 dpi的檢測結(jié)果一致。在CYMV-3接種陽性植株的新葉上，觀察到與前人報(bào)道[3,8]的CYMV癥狀類似的點(diǎn)狀褪綠斑點(diǎn)（圖4），初步表明CYMV-2和CYMV-3可能為侵染性克隆。

圖4 CYMV-3接種尤力克檸檬的癥狀

2.1.4 CYMV侵染性克隆的序列分析 序列分析結(jié)果顯示，CYMV-2與CYMV-3的序列一致性為100%，均包含1.4倍CYMV基因組全長序列。CYMV-3基因組全長7 559 bp，包含6個(gè)順時(shí)針排列的ORF。其中ORFⅠ全長432 bp，位于基因組核苷酸第231—662位，編碼143個(gè)氨基酸；ORFⅡ全長414 bp，位于基因組核苷酸第659—1 072位，編碼137個(gè)氨基酸；ORFⅢ是最長的ORF，全長5 952 bp，位于基因組核苷酸第1 069—7 020位，與ORFⅡ有4個(gè)堿基重疊；ORFⅣ和ORFⅤ完全包含于ORFⅢ。ORFⅣ全長540 bp，位于基因組核苷酸第1 973—2 512位；ORFⅤ全長288 bp，位于基因組核苷酸第3 977—4 264位；ORFⅥ全長465 bp，位于基因組核苷酸第6 594—7 058位，與ORFⅢ有427 bp重疊。除這些ORF外，還有一個(gè)731 bp的IR，包含轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件。

核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，CYMV-3與已登錄NCBI的9個(gè)CYMV分離株基因組序列同源性為90%—100%，其中與印度甜橙分離物CYMV-SO（AF347695）的序列同源性最高，與CYMV分離株SO Nagri（FJ617224）、SO JNTU（JN006805）、ALAP（EU708317）同源性大于95%，而與其他桿狀DNA病毒如可可腫枝病毒（cacao swollen shoot virus，CSSV）、薯蕷桿狀病毒（Dioscorea bacilliform SN virus，DaBV）、鴨跖草黃斑駁病毒（Commelina yellow mottle virus，CoYMV）等的同源性為90%—100%。

依據(jù)CYMV-3與其他已知桿狀DNA病毒的核苷酸序列，使用鄰接距離矩陣法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示（圖5），所有CYMV分離株聚為兩個(gè)分支，其中CYMV-3與CYMV SO、CYMV SO JNTU，CYMV SO Nagri聚在一個(gè)分支，并與CYMV SO分離株的親緣關(guān)系最近；CYMV分離株與其他桿狀DNA病毒如CSSV、DaBV、CoYMV等在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于不同的遺傳分支，這與序列比對(duì)結(jié)果一致。

CYMV：柑橘黃化花葉病毒citrus yellow mosaic virus；CSSV：可可腫枝病毒Cacao swollen shoot virus；DaBV：薯蕷桿狀病毒Dioscorea bacilliform SN virus；PYMoV：辣椒黃化斑駁病毒Piper yellow mottle virus；DrMV：龍血樹屬斑駁病毒Dracaena mottle virus；TaBV：芋頭桿狀病毒Taro bac-illiform virus；CoYMV：鴨跖草黃斑駁病毒Commelina yellow mottle virus；PBCV：菠蘿桿狀病毒Pineapple bacilliform comosus virus；BSV：香蕉條斑病毒Banana streak GF virus；KTSV：伽藍(lán)菜頂端斑點(diǎn)病毒Kalanchoe top-spotting virus；ScBV：甘蔗桿狀病毒Sugarcane bacilliform virus；GVBV：醋栗脈帶伴隨病毒Gooseberry vein banding virus

2.1.5 CYMV-3的侵染性鑒定 提取CYMV-3侵染并顯癥的尤力克檸檬系統(tǒng)新葉DNA，使用引物CYMV-1F/R和CYMV-2F/R分兩段擴(kuò)增CYMV全長基因組。結(jié)果顯示（圖6），分別擴(kuò)增獲得長度約3 654和3 905 bp的特異性條帶，與理論預(yù)期長度一致，并覆蓋了CYMV基因組長度。

M：5000 bp marker；1—3：CYMV分段擴(kuò)增第一段PCR amplification of the first segment of CYMV；5—7：CYMV分段擴(kuò)增第二段PCR amplification of the second segment of CYMV；4、8：陰性對(duì)照Negative control

將CYMV-3侵染植株通過嫁接接種1年生粗檸檬實(shí)生苗，并在90 dpi提取系統(tǒng)新葉總核酸使用引物CYMV-JC-F/R進(jìn)行RT-PCR檢測，在8株中有2株檢測出特異性條帶（圖7）。進(jìn)一步證明CYMV-3為侵染性克隆。

桿狀DNA病毒屬成員的病毒粒子特征為圓形末端，側(cè)邊平行，無病毒包膜的桿狀結(jié)構(gòu)。粒子直徑一般為25—30 nm，長度最小60 nm，最長可達(dá)900 nm，大部分為30 nm×130 nm，無突起及其他殼外結(jié)構(gòu)。病毒粒子主要分布場所是細(xì)胞質(zhì)，少量分布于液泡中，分布呈分散或柵欄式集中排列[25]。取CYMV-3侵染植株顯癥葉片進(jìn)行固定、制片，通過透射電鏡觀察，在病變?nèi)~細(xì)胞液中發(fā)現(xiàn)大小約130 nm×30 nm的CYMV桿狀病毒粒子（圖8）。

M：2000 bp marker；1—8：嫁接接種植株P(guān)lant inoculated by grafting；9、10：陰性對(duì)照Negative control；11、12：陽性對(duì)照Positive control

圖8 CYMV-3侵染柑橘植株的病毒粒子觀察

2.2 CYMV-3接種不同柑橘品種、草本植物

2.2.1 CYMV-3通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空浸潤接種不同品種柑橘 選取CYMV-3接種W·默科特、22號(hào)枳等10個(gè)不同柑橘品種，在90 dpi提取總核酸檢測，對(duì)陽性植株進(jìn)行持續(xù)癥狀觀察。RT-PCR檢測結(jié)果表明，22號(hào)枳、玉環(huán)柚、晚白柚、威爾金柳葉橘、金橙蜜柚、哈姆林甜橙、W·默科特7個(gè)品種的侵染率為100.00%（4/4）、100.00%（5/5）、50.00%（2/4）、33.33%（1/3）、25.00%（2/8）、11.76%（2/17）、11.11%（1/9）；馬水橘、3號(hào)椪柑、大果甜橙3個(gè)品種的侵染率為0；平均侵染率為24.63%。癥狀觀察顯示（圖9），4個(gè)品種表現(xiàn)出癥狀，22號(hào)枳出現(xiàn)沿葉脈黃化，晚白柚出現(xiàn)黃化斑塊，金橙蜜柚出現(xiàn)輕微花葉，哈姆林甜橙出現(xiàn)中度黃化。

2.2.2 CYMV-3注射接種不同品種柑橘 CYMV-3注射接種摩洛哥酸橙、粗檸檬等5個(gè)柑橘品種，在30和180 dpi分別提取總核酸去除DNA后進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明，粗檸檬、摩洛哥酸橙、MV甜橙、強(qiáng)德勒柚、鄧肯葡萄柚的侵染率分別為90.00%（18/20）、85.00%（17/20）、80.00%（12/15）、68.42%（13/19）、63.16%（12/19），平均侵染率74.00%，顯著高于真空浸潤接種。其中3個(gè)品種出現(xiàn)侵染癥狀，粗檸檬出現(xiàn)沿葉脈擴(kuò)散的黃化花葉癥狀，MV甜橙出現(xiàn)馬賽克狀花葉癥狀，鄧肯葡萄柚葉片出現(xiàn)斑塊狀褪綠癥狀（圖9）。

2.2.3 CYMV-3注射接種草本植物 本氏煙、玉米、豇豆和高粱在10、45和120 dpi取系統(tǒng)新葉提取總核酸使用引物CYMV-JC-F2/R2進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株高粱植株呈陽性（圖10），并且系統(tǒng)葉片沿葉脈周邊出現(xiàn)條狀褪綠帶（圖11），可見CYMV能夠侵染高粱。本氏煙、玉米、豇豆植株RT-PCR檢測結(jié)果均呈陰性。

圖9 CYMV-3接種不同品種柑橘癥狀

M：2000 bp marker；1—21：CYMV-3注射接種高粱S. bicolor inoculated with CYMV-3；22：陽性對(duì)照Positive control；23、24：陰性對(duì)照Negative control

2.3 CYMV ORFⅠ和ORFⅡ突變體

2.3.1 突變體檢測 通過同源重組構(gòu)建了ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的CYMV-3突變體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，利用引物GFP-JC-F/R進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果分別檢測到2個(gè)陽性單克?。▓D12），其測序結(jié)果與預(yù)期序列一致性為100%，表明ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的突變體構(gòu)建成功，分別命名為CYMV 3-1和CYMV 3-2。

圖11 CYMV-3接種高粱的癥狀

M：2000 bp marker；1、2：突變體CYMV 3-1 mutant CYMV 3-1；4、5：突變體CYMV 3-2 mutant CYMV 3-2；3、6：陰性對(duì)照Negative control；7：陽性對(duì)照Positive control

2.3.2 CYMV-3突變體接種柑橘 CYMV 3-1和CYMV 3-2分別通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種粗檸檬，并以CYMV-3為對(duì)照。60和120 dpi的RT-PCR檢測結(jié)果表明，除正對(duì)照呈陽性外，所有接種植株均為CYMV陰性，表明CYMV 3-1和CYMV 3-2無侵染性，推測CYMV的ORFⅠ和ORFⅡ?qū)ζ淝秩拘钥赡苁潜匦璧摹?/p>

3 討論

3.1 CYMV侵染性克隆的構(gòu)建

本試驗(yàn)獲得了CYMV的1.4倍基因組長度的DNA克隆。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空浸潤尤力克檸檬實(shí)生苗，提取陽性植株總DNA，可擴(kuò)增出CYMV全長基因組序列；對(duì)CYMV侵染顯癥植株的葉片進(jìn)行電鏡切片觀察，可見大小約130 nm×30 nm的桿狀病毒粒子；取顯癥植株的皮組織嫁接到粗檸檬實(shí)生苗上，通過RT-PCR在系統(tǒng)葉可檢測到CYMV特異性條帶。綜上，CYMV侵染性克隆構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究其分子特性打下了基礎(chǔ)。不過，本試驗(yàn)電鏡觀察中所呈現(xiàn)的病毒粒子較少，可能是由于病毒含量較低所致，后期可通過病毒提純[11]的方法以便更清晰觀察到病毒粒子形態(tài)。

3.2 CYMV侵染植株的癥狀

CYMV引起的花葉癥狀易與礦物質(zhì)缺乏和柑橘葉斑駁、柑橘黃化病等早期癥狀相混淆，該病毒典型癥狀是葉片呈黃色馬賽克狀或沿葉脈呈不規(guī)則淺綠色斑塊狀，且不同柑橘品種間癥狀有差異[9]。本試驗(yàn)中，在MV甜橙上表現(xiàn)為典型馬賽克癥狀，而在其他品種中表現(xiàn)為黃化斑駁等癥狀。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種了多種草本植物，發(fā)現(xiàn)CYMV未能侵染本氏煙、玉米和豇豆，但能侵染高粱并引起沿葉脈斑駁褪綠癥狀。

3.3 接種方式及寄主對(duì)侵染率的影響

農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種是目前最廣泛和最經(jīng)濟(jì)的病毒侵染性克隆的接種方式，但其侵染效率受多種因素影響，如接種部位、共培養(yǎng)溫度、農(nóng)桿菌濃度、植株培養(yǎng)方式等。本研究發(fā)現(xiàn)，CYMV-3注射接種侵染率較真空浸潤接種顯著升高。推測是由于通過真空浸潤對(duì)接種植株細(xì)胞產(chǎn)生了較大的損傷，與農(nóng)桿菌侵入共同作用引起植物細(xì)胞的活性氧爆發(fā)。隨后，植物細(xì)胞啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），造成侵染率下降[26]。而注射接種對(duì)植株造成的損傷較小且進(jìn)入植株體內(nèi)的農(nóng)桿菌相對(duì)量較低，引起的防御反應(yīng)較弱，提高了農(nóng)桿菌的生存率，從而提高了侵染率，這為后續(xù)CYMV基因功能等研究提供了一種方便、快捷、高效的接種方式。

Dakshinamurti等[27]報(bào)道CYMV可通過葉片嫁接傳播到木槿（），這是CYMV侵染非柑橘宿主的第一例報(bào)道。其后，Aparna等[28]證明CYMV可以侵染美人蕉、高粱和玉米而不侵染本生煙等其他21種非柑橘植物。本研究中，將CYMV-3侵染性克隆通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種玉米、豇豆、本氏煙和高粱，發(fā)現(xiàn)其能侵染高粱，對(duì)玉米、豇豆和本氏煙則無法成功侵染，這與Aparna等[28]的結(jié)果部分一致。在本試驗(yàn)中CYMV-3未能侵染玉米的原因可能是由于接種方法不同造成的，Aparna等通過摩擦接種直接將病毒粒子傳送到玉米植株，病毒粒子內(nèi)包含了其侵染復(fù)制所必需的某種元件如外殼蛋白，而侵染性克隆通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種缺少了該必需元件。

3.4 CYMV ORFⅠ和ORFⅡ功能

據(jù)推測，CYMV ORFⅠ是一種病毒結(jié)合蛋白，編碼一種由143個(gè)氨基酸組成的多肽，含有與同屬模式病毒ComYMV ORFⅠ相同的產(chǎn)物保守區(qū)域[29]，該ORF已被證明能與病毒粒子結(jié)合。CYMV ORFⅡ編碼137個(gè)氨基酸的多肽，與CSSV的ORFⅡ產(chǎn)物具有同源性，推測是一種核酸結(jié)合蛋白[15]。本研究構(gòu)建了CYMV ORFⅠ和ORFⅡ分別替換為的突變體，接種粗檸檬后均未能檢測到陽性植株，這表明CYMV ORFⅠ和ORFⅡ可能與病毒侵染相關(guān)，相關(guān)證據(jù)有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了CYMV的侵染性克隆，可使受侵染植株表現(xiàn)斑駁、花葉和馬賽克等典型癥狀。該克隆通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射接種比真空浸潤接種柑橘具有顯著提高的侵染率，且易于操作。

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Construction and application of Infectious Clone of Citrus Yellow Mosaic Virus

JIANG QiQi, XU JianJian, SU Yue, ZHANG Qi, CAO Peng, SONG ChenHu, LI ZhongAn, SONG Zhen

Citrus Research Institute, Southwest University/National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712

An infectious clone of citrus yellow mosaic virus (CYMV) was constructed to lay a foundation for further study of its molecular characteristics and pathogenic mechanism.the amplified CYMV genomic sequence segments were recombined with the ternary expression vector pCY using In-Fusion homologous recombination technology, and a 1.4-fold full-length genomic DNA clone of the virus was constructed and sequenced. The obtained clones were inoculated onto seedlings of Eureka lemon by-mediated vacuum infiltration (AVI), and their infectivity was identified by molecular detection, presentation of symptoms and virus particles, and re-grafting determination. The obtained infectious clones were used to inoculate different citrus varieties and herbs, and the infection rate was determined by RT-PCR and the various symptoms of different citrus varieties after infection were observed. Mutants of the infectious clones with ORFⅠand ORFⅡ replaced by green fluorescent protein gene (), respectively were constructed, and subjected to infectivity analysis.Seven clones of 1.4-fold CYMV genome-length DNA were obtained by In-Fusion homologous recombination technology. Among them, CYMV-3 was 90%-100% identical to the corresponding genomic nucleotide sequences of nine CYMV isolates registered in GenBank, and had the highest homology with CYMV-SO isolate (AF347695) and was clustered on the same branch of the genetic evolutionary tree. The results of infectivity identification showed that four out of the 14 Eureka lemon plants inoculated with CYMV-3 were positive by RT-PCR detection, and punctate chlorotic symptoms were observed. DNA was extracted from the new systemic leaves of the infected plant and the expected specific fragments covering the full length of the CYMV genome were obtained by PCR amplification. CYMV-3 infected plants with symptoms were used as the virus source to graft and inoculate rough lemon seedlings, and CYMV specific bands could be detected by RT-PCR at 90 dpi. New leaves of CYMV-3 infected plants with symptoms were taken for fixation and sectioning for electron microscopy and baculovirus particles of about 130 nm × 30 nm were observed, indicating that CYMV-3 was a CYMV infectious clone. Ten and five citrus varieties were inoculated by CYMV-3 via-mediated vacuum infiltration and injection, respectively, and were tested by RT-PCR. The results showed that the infection rate of the former was 11.11%-100.00% and the latter was 63.16%-90.00%. Some citrus varieties appeared CYMV symptoms such as yellowing, mosaic and yellowing patches.,s,andwere inoculated by CYMV-3 via-mediated injection, and onlyplants were detected to be positive in RT-PCR detection, and chlorotic strips appeared along the veins of the systemic leaves, indicating that CYMV can infect. The mutants of CYMV-3 with ORFⅠand ORFⅡ replaced by, respectively, were constructed and inoculated onto rough lemons by-mediated injection. All the inoculated plants were negative by RT-PCR detection and showed no obvious symptoms.The infectious clone of CYMV was successfully constructed and could infected citrus plants efficiently via-mediated injection, resulting different symptoms in different varieties.

citrus yellow mosaic virus (CYMV); infectious clone;-mediated inoculation; mutant

2022-07-18；

2022-09-13

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1400800）、重慶市自然科學(xué)基金（CSTB2022NSCQ-MSX0752）

蔣琪琪，E-mail：j13206107876@163.com。許建建，E-mail：swuxujj@foxmail.com。蔣琪琪和許建建為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者宋震，E-mail：songzhen@cric.cn。通信作者李中安，E-mail：lizhongan@cric.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）