季青霞，陳 偉，畢艷紅，趙祥杰，白青云，王朝宇

（淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223003）

0 引言

水芹，又名為野芹菜、水英等，屬藥食同源的植物，主要種植在長(zhǎng)江流域，歷史悠久［1］。水芹不但含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［2］，還含有黃酮、酚酸和揮發(fā)油等藥用成分，對(duì)高血壓、高血糖和高血脂等患者具有很好的治療效果［3］。水芹中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)抑制肝臟脂肪增加、抗B型肝炎病毒和抗糖尿病等作用顯著［4］。目前，水芹主要以鮮食為主，其深加工制品比較少見。因此，擴(kuò)大水芹精深加工、提高產(chǎn)品附加價(jià)值、延伸水芹產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

黃酮類化合物是一種常見于植物中的天然酚類物質(zhì)，具有C6-C3-C6的基礎(chǔ)骨架，是植物代謝中生成的次級(jí)產(chǎn)物［5］，分為總黃酮、異黃酮、花青素和黃酮醇［6］。該類化合物是一類廣譜藥用成分，具有抗炎抑菌、保護(hù)神經(jīng)組織、延緩衰老和抗血小板過(guò)度聚集等功效［7］。當(dāng)前植物中黃酮類化合物的提取有多種方法，如超聲波提取法、水浴提取法、超臨界流體萃取技術(shù)、大孔吸附樹脂法及微波輔助提取法等［8］，其中超聲輔助工藝提取黃酮類化合物具有操作簡(jiǎn)便和效率高等特點(diǎn)，廣泛用于黃酮類化合物提取。

本文以水芹為研究對(duì)象，考察料液比、提取劑濃度、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)水芹黃酮類化合物提取率的影響，并采用響應(yīng)面法對(duì)相關(guān)的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化［9］。在此基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助技術(shù)有效縮短提取時(shí)間，強(qiáng)化水芹黃酮類化合物的提取效率，為植物中黃酮類化合物的提取提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮水芹，產(chǎn)自淮安；蘆丁標(biāo)品（青島泰東制藥有限公司）；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

V-5000H型可見紫外分光光度計(jì)（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限公司）；HH-M4型水浴鍋（上海赫田科技儀器有限公司）；DSA100-GL1型超聲波機(jī)（福州德森精工有限公司）；BJ-800A型粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；FXB202-4型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

新鮮水芹→烘干（50 ℃，2.0 h）→粉碎→過(guò)篩（80目）→取一定質(zhì)量的水芹粉末加入提取溶劑→放入水浴鍋或超聲波儀器中提取→抽濾得提取液體。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)千春錄等［10］的方法，稍加改變，精確稱取11.0 mg蘆丁，置于干燥箱中50 ℃恒溫干燥2.0 h，待冷卻放入100 mL的容量瓶中，再用70%的乙醇溶液進(jìn)行定容直至100 mL，獲得0.11 mg/mL蘆丁溶液。取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 的蘆丁溶液，分別放置于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min；加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液5.0 mL，靜置15 min；最后用70%的乙醇溶液定容至25 mL，獲得7個(gè)梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定510 nm下蘆丁溶液的吸光值，建立蘆丁濃度與吸光度值的線性關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 提取率測(cè)定

準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣液1.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制操作步驟，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出吸光度相應(yīng)的蘆丁含量。按下式計(jì)算黃酮提取率：

式中 Y —— 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣液濃度，mg/mL；

N —— 稱取的用以提取黃酮類化合物的水芹重量，g。

1.3.4 水浴提取法單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）料液比對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，用70%乙醇溶液分別按1：10，1：20，1：30，1：40，1：50（g/mL）的料液比在80 ℃下水浴提取90 min，濾液定容到100 mL。測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量，并計(jì)算提取率。

（2）乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，按料液比1：40（g/mL）分別加入50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，在80 ℃下水浴提取90 min，抽濾，濾液定容至100 mL。測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量，并計(jì)算提取率。

（3）提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，按料液比1：40（g/mL）加入80%的乙醇溶液，在80 ℃下分別提取30，60，90，120，150 min，抽濾，濾液定容到 100 mL。測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量，并計(jì)算提取率。

（4）提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，按料液比1：40（g/mL）加入 80% 的乙醇溶液分別在 40，50，60，70，80 ℃的溫度下水浴提取120 min，抽濾，濾液定容到100 mL。測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量，并計(jì)算提取率。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化黃酮類化合物提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)［11］。分別選取料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素作為試驗(yàn)自變量，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以黃酮類化合物提取率為響應(yīng)值，確定最佳提取工藝參數(shù)，試驗(yàn)方案如表1所示。每組試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，黃酮類化合物的提取率取其平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels for response surface analysis

1.3.6 超聲波提取法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）超聲波功率對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，用80%乙醇溶液以料液比 1：40（g/mL）在 70 ℃的溫度下以 20 kHz的頻率分別以 60，70，80，90，100 W 的功率提取10 min后過(guò)濾，將抽濾后的液體定容到100 mL。比較不同超聲功率對(duì)黃酮類化合物提取率的影響。

（2）提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響。精確稱量0.5 g干燥的水芹粉末，用80%乙醇溶液以料液比1：40（g/mL）在70 ℃條件下，超聲波頻率20 kHz，超聲功率 60 W，水浴中分別提取 3，5，10，15，20 min后抽濾，濾液定容到100 mL。比較不同提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)水芹黃酮提取率的影響

料液比對(duì)水芹黃酮提取率的影響如圖1所示。隨著液體比例逐漸增大，黃酮類化合物的提取率隨之上升，當(dāng)料液比達(dá)到1：40 g/mL時(shí)，提取率趨于平緩。這是由于液體比例的增加，使得黃酮類化合物更易溶出，但達(dá)到最大溶解度后，黃酮類化合物的溶出不再增加［12］。因此，選擇料液比為1：40（g/mL）為宜。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

根據(jù)相似相溶原理，不同溶劑的溶解度和擴(kuò)散程度對(duì)黃酮提取的影響較大。不同濃度的乙醇溶液對(duì)水芹黃酮提取率的影響如圖1所示。隨著乙醇濃度增加，黃酮類化合物的提取率不斷增加。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，黃酮類化合物提取率達(dá)到最高，但乙醇濃度繼續(xù)增加，提取率呈下降趨勢(shì)。這是由于黃酮溶解性因極性不同而有所差異，80%乙醇的極性與水芹中黃酮類化合物的極性相似，但隨著乙醇濃度增加，脂溶性物質(zhì)等析出，影響黃酮類化合物的溶出［13］。故乙醇濃度選擇80%為宜。

圖1 料液比及乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響Fig.1 The effect of solid-to-liquid ratio and ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響如圖2所示。隨著提取時(shí)間的增加，黃酮類化合物的提取率也顯著提高。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到120 min時(shí)，提取率最高，隨后趨于平緩。這是由于隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮類化合物不斷溶出，但達(dá)到一定提取時(shí)間，水芹中大部分黃酮類化合物已被提取，所以不再增加，且達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，水浴提取時(shí)間選擇120 min為宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

溫度對(duì)分子的擴(kuò)散速度有一定的影響，如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間及提取溫度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響Fig.2 The effect of extraction time and extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

隨著提取溫度的上升，黃酮類化合物的提取率也隨之上升。當(dāng)提取溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，提取率最高，這是由于溫度越高分子擴(kuò)散速率越快，黃酮類化合物析出增加，然而溫度過(guò)高也會(huì)增加其他非黃酮成分的溶出［14］，影響黃酮類化合物的提取率。因此70 ℃為黃酮類化合物的最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化水芹黃酮提取工藝研究

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，使用Design Expert 11設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，得到29組試驗(yàn)結(jié)果。A、B、C、D分別為料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度，以黃酮類化合物提取率為響應(yīng)值進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2.2 回歸方程的建立及統(tǒng)計(jì)分析

用方差分析的F檢驗(yàn)對(duì)回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果列于表2。

表2 回歸模型方差分析Tab.2 Analysis of variance of regression model

通過(guò)試驗(yàn)得到料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度因素之間的三維響應(yīng)面與等高線，根據(jù)表2回歸模型方差分析，以黃酮類化合物提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合，響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果符合二次回歸方程。

模型F值為15.40，顯著性分析得P＜0.000 1＜0.001，說(shuō)明試驗(yàn)所得的回歸模型對(duì)黃酮類化合物提取率有很好的預(yù)測(cè)性。失擬值為5.58，P=0.056＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況良好［15］。根據(jù)表2各方差分析，A、B、C、AB、AC、AD、BC、BD、A2、B2、C2項(xiàng)（P（Pr＞F）＜0.05）對(duì)黃酮類化合物提取率影響顯著。相關(guān)系數(shù)R2=0.939與調(diào)整相關(guān)系數(shù)Adj-R2=0.878都接近1，說(shuō)明測(cè)定值與預(yù)測(cè)值之間有極高的擬合度［16］。

根據(jù)響應(yīng)面分析建立的數(shù)學(xué)模型，得到最佳工藝條件：料液比1：40（g/mL），乙醇溶液濃度80%，提取時(shí)間120 min，提取溫度70 ℃。在此條件下黃酮類化合物預(yù)測(cè)值為11.14%。根據(jù)最佳工藝條件做3個(gè)平行試驗(yàn)，黃酮類化合物提取率達(dá)到11.16%，與預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明所建模型與實(shí)際情況擬合良好。

2.2.3 響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化

響應(yīng)面圖3直觀地反映料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度之間交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響。各因素之間交互作用均呈現(xiàn)先上升后下降的拋物線型關(guān)系，說(shuō)明兩兩交互均對(duì)水芹黃酮類化合物提取率有較大的影響。

圖3 不同因素對(duì)黃酮類化合物提取率的影響Fig.3 Effect of different factors on flavonoids extraction rate

2.3 超聲波輔助提取對(duì)水芹黃酮提取率的影響

2.3.1 超聲波功率對(duì)黃酮提取率的影響

超聲波能在液體中產(chǎn)生強(qiáng)烈空化效應(yīng)，增加溶劑穿透力，加速溶質(zhì)析出，從而提高提取效率。同時(shí)產(chǎn)生的熱效應(yīng)，在一定的溫度條件下，有利于植物有效成分的析出。如圖4所示，隨著超聲波功率的增強(qiáng)，黃酮類化合物提取率也隨之上升。當(dāng)超聲功率達(dá)到70 W時(shí)，黃酮的提取率最高。這是由于超聲功率對(duì)溶劑體系機(jī)械振動(dòng)的影響較大，使黃酮類化合物易溶出。但超聲波功率過(guò)高，熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致有效成分被破壞，從而提取率下降［17］。因此，選擇超聲波功率為70 W為宜。

2.3.2 超聲波提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

圖4顯示，在其他條件相同的情況下，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為10 min時(shí)，黃酮類化合物提取率最高；當(dāng)超過(guò)10 min時(shí)，黃酮類化合物提取率下降。這是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致黃酮類化合物的熱不穩(wěn)定和降解［18］。與水浴提取時(shí)間進(jìn)行比較，水浴提取120 min提取率才能達(dá)到11.16%，而超聲波提取10 min可達(dá)到11.21%提取率?？梢?，超聲波提取比水浴提取效率高。因此，當(dāng)超聲波提取時(shí)間為10 min時(shí)，黃酮類化合物提取率最佳。

圖4 超聲波對(duì)黃酮類化合物提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic on the extraction rate of flavonoids

3 結(jié)語(yǔ)

以水芹為原料，采用超聲波輔助法提取其中的黃酮類化合物。通過(guò)單因素考察及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到超聲輔助最佳提取條件為料液比1：40（g/mL）、乙醇濃度80%、提取溫度70 ℃、超聲波功率70 W和提取時(shí)間10 min，此條件下黃酮類化合物提取率達(dá)11.21%。超聲波輔助提取工藝與傳統(tǒng)水浴提取工藝相比，可將提取時(shí)間顯著縮短91.67%，大大提升黃酮類化合物提取效率。超聲輔助工藝對(duì)植物中黃酮類化合物的提取具有強(qiáng)化作用。