徐文祥，李毅翔，卞宏生，王紅坤，黃莉莉，李廷利，王艷艷

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

0 引言

酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujuba Mi11.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou）的干燥成熟種子［1］。主要含脂肪油、皂苷、黃酮、生物堿及多糖等成分［2］，具有補(bǔ)中益氣、寧心安神、斂汗生津的功效［3］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，酸棗仁中的黃酮類和酚類化合物具有顯著的抗氧化作用［4］，但酸棗仁中總皂苷和多糖類成分的抗氧化活性鮮有報(bào)道。因此，本文采用Box-Behnken法優(yōu)化酸棗仁總皂苷和多糖提取工藝，并利用3種體外抗氧化試驗(yàn)對(duì)酸棗仁不同炮制品的抗氧化作用進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁由中國(guó)山西省陽(yáng)泉市某棗仁廠提供；水楊酸、氯化鐵、鉬酸銨、磷酸三鈉、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸（天津永盛精細(xì)化工有限公司）；冰醋酸、高氯酸、香蘭素、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（天津凱通化學(xué)試劑有限公司）。

THC-20B型超聲波提取設(shè)備（濟(jì)寧天華超聲波電子儀器有限公司）；MS105型分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）；DHG-9055 104型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海道瀚實(shí)業(yè)有限公司）；SynergyMX型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

生酸棗仁：取適量干燥酸棗仁粉碎過(guò)24目篩后脫脂備用。

炒制酸棗仁：生酸棗仁置炒鍋內(nèi)在130 ℃炒制4 min，并按照生酸棗仁處理。

生-炒配伍：脫脂生酸棗仁與脫脂炒酸棗仁按質(zhì)量比1：1配置而成。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

（1）總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱定皂苷B標(biāo)準(zhǔn)品 4.17 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻；分別精密移取 120，220，280，360，440，520 μL于10 mL具塞試管中，依次加入5 %香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL，HClO40.8 mL，搖勻，密封，置60 ℃水浴中加熱15 min，立即置于冰水浴中冷卻2 min，精密加入HAC 5.0 mL，搖勻。測(cè)其吸光度，最大吸收波長(zhǎng)480 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。利用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，精密稱定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.9 mg于10 mL容量瓶中，用水定容，搖勻；分別精密移取 5，10，15，20，25，30，35，40 μL 于離心管中，分別加入蒸餾水稀釋至60 μL，再加入180 μL由5%苯酚溶液與98%濃硫酸按體積比1：5混合制成的顯色液，混勻后沸水浴中加熱25 min，冷卻。酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝

試驗(yàn)以超聲功率、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間為考察因素，利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用4因素3水平的Box-Benhnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels in response surface design

表2 總皂苷和多糖Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Tab.2 Experimental design and response value of total saponin and polysaccharide by Box-Behnken method （單位：%）

1.2.4 酸棗仁不同炮制品及配伍形式的總皂苷和多糖含量測(cè)定

精密稱定不同配伍酸棗仁0.5 g，按照總皂苷和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下步驟進(jìn)行試驗(yàn)。按下式測(cè)出不同配伍酸棗仁總皂苷和多糖含量：

式中 n ——稀釋倍數(shù)；

C ——所測(cè)成分的濃度，mg/mL；

V ——準(zhǔn)確移取所測(cè)樣品的體積，mL；

m ——準(zhǔn)確稱取的樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 酸棗仁不同炮制品的體外抗氧化試驗(yàn)

（1）DPPH法抗氧化試驗(yàn)。將0.1 mL提取液與0.1 mL DPPH（0.25 mmol/L，無(wú)水乙醇溶解）充分混勻后，避光保存30 min，在 517 nm 處測(cè)吸光度A樣品。空白組用0.1 mL無(wú)水乙醇溶液替代DPPH溶液，對(duì)照組則取 0.1 mL與提取濃度相同的乙醇替代樣品溶液，在波長(zhǎng) 517 nm 處對(duì)樣品測(cè)定吸光度［5］，平行3次取平均值。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

（2）-OH清除抗氧化試驗(yàn)。取150 μL待測(cè)物加入各1.0 mLFeSO4溶液（6 mmol/L）、H2O2溶液（6 mmol/L）和水楊酸乙醇溶液（6 mmol/L），混勻后37 ℃水浴1 h，酶標(biāo)儀測(cè)得510 nm處吸光度。對(duì)照組取1.0 mL蒸餾水作為樣品溶液，其余步驟同樣品組，測(cè)定空白吸光度［6］。-OH自由基清除率按下式計(jì)算：

（3）磷鉬酸總抗氧化試驗(yàn)。取1.065 g磷酸三納、0.494 g鉬酸銨和3.28 mL濃硫酸混勻，定容于100 mL容量瓶中，取0.1 mL待測(cè)物與3.0 mL該混合溶液混合，95 ℃水浴1.5 h，在波長(zhǎng)695 nm 處測(cè)定其吸光度，平行3次取平均值。以蒸餾水作為空白對(duì)照［7］?？偪寡趸芰Π聪率接?jì)算：

式中 n ——稀釋倍數(shù)；

C ——測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，mg/mL；

V ——提取液的體積，mL；

m ——酸棗仁干粉重量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

以酸棗仁皂苷質(zhì)量濃度（x1，g/mL）對(duì)吸光度Y1進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y1=2.955 7x1-0.056 1，R2=0.998 8。結(jié)果顯示總皂苷在0.084～2.570 mg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x2，g/mL）對(duì)吸光度Y2進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y2=0.060 8x2+0.173 2，R2=0.998 3。結(jié)果顯示多糖在吸光度2.95～23.6 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.2.1 回歸方程與方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件分別對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合，得到總皂苷提取率響應(yīng)值（Y）和超聲功率（A）、液固比（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和提取時(shí)間（D）之間的二次回歸方程：

多糖提取率響應(yīng)值（Y）和各因子（A、B、C、D）之間的二次回歸方程：

回歸方程中系數(shù)的絕對(duì)值反映了各影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響因素大小［8］。

表3 總皂苷回歸方程模型方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the model variance analysis of the total saponins regression equation

表4 多糖回歸方程模型方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the model variance analysis of the polysaccharide regression equation

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到酸棗總皂苷提取曲面分析結(jié)果，等高線反應(yīng)各因素之間交互作用的強(qiáng)弱，圓形表示交互作用弱，橢圓形表示交互作用強(qiáng)［11］。從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)也可看出，一次項(xiàng)中影響極顯著因素為B；在所選的各因素水平范圍內(nèi)，影響酸棗仁的總皂苷提取的因素順序?yàn)锽＞A＞D＞C。酸棗多糖提取曲面分析結(jié)果顯示，一次項(xiàng)中因素C偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平；在所選的范圍內(nèi)，影響酸棗仁多糖提取的因素順序?yàn)镃＞A＞B＞D。

2.2.3 酸棗仁的總皂苷和多糖提取方法驗(yàn)證工藝

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝確定總皂苷提取的超聲功率為228.5 W，液固比為70：1，乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，提取時(shí)間為21.1 min。對(duì)該方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，總皂苷提取率為11.28%，模型理論值為12.48%，偏差為9.6%。同時(shí)確定多糖提取的超聲功率為200 W，液固比為70：1，乙醇體積分?jǐn)?shù)21.2%，提取時(shí)間為27.7 min。對(duì)該方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖提取率為7.28%，模型理論值為7.75%，偏差為6.06%。

2.3 酸棗仁不同炮制品中總皂苷和多糖含量及體外抗氧化作用測(cè)定結(jié)果

如表5所示，等比的生、炒酸棗仁和生-炒配伍比較總皂苷和多糖含量，結(jié)果顯示炒酸棗仁的總皂苷含量比生、生-炒配伍含量高，而多糖含量生-炒配伍＞生酸棗仁＞炒酸棗仁。推測(cè)原因可能為生酸棗仁種皮堅(jiān)韌，細(xì)胞破壁困難，有效成分難以溶出，而經(jīng)過(guò)炮制后，其質(zhì)地酥脆，有效成分易于溶出［12］，故酸棗仁中總皂苷得率比生品高。同時(shí)，酸棗仁中的多糖成分不耐高溫，經(jīng)炮制后多糖易被降解，所以含量略有下降。因此，與生、炒酸棗仁相比，生-炒配伍酸棗仁可提升多糖得率。據(jù)SPSS statistics 21軟件相關(guān)性分析可知，總皂苷與多糖含量與DPPH清除能力呈顯著性關(guān)系，多糖與總抗氧化能力呈極顯著性關(guān)系。

表5 總皂苷和多糖含量及體外抗氧化作用試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Saponin and polysaccharide content and antioxidant activity in vitro on jujube kernels

3 結(jié)語(yǔ)

本文利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以超聲功率、液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間為考察因素，建立超聲提取酸棗仁總皂苷和多糖的最佳工藝條件。相較于傳統(tǒng)的提取方法［13］，試驗(yàn)提取得到的酸棗仁總皂苷和多糖含量顯著提高。同時(shí)，對(duì)酸棗仁不同炮制品中總皂苷、多糖含量和抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，酸棗仁經(jīng)炒制后，總皂苷含量升高，多糖含量降低，DPPH自由基和-OH清除能力增強(qiáng)，總抗氧化能力下降?？傇碥张c多糖含量與DPPH清除能力具有顯著性關(guān)系，多糖與總抗氧化能力呈極顯著性關(guān)系。已有文獻(xiàn)報(bào)道，多糖可以通過(guò)提供氫離子或者電子，結(jié)合自由基。同時(shí)多糖鏈上的多個(gè)羥基還能與產(chǎn)生自由基所需的Fe2+或者Cu2+等金屬離子絡(luò)合，減少自由基生成［14］。因此，酸棗仁多糖具有良好的供氫能力，能直接作用于自由基，從而發(fā)揮抗氧化效能。綜上，酸棗仁的總皂苷和多糖類成分均具有一定的抗氧化作用，炒制后可以增加皂苷類成分，提高其抗氧化能力，增加其臨床應(yīng)用價(jià)值。