張 蒙，王瑞芬，管雯斌，孫也淇，李凌軒，李俊磊，王立峰

胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)EBV感染與胃癌有關(guān)。2014年癌癥基因組圖譜(TCGA)提出EBV相關(guān)性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)是一種特殊的亞型，是免疫治療的主要受益群體[3]。EBVaGC是一組具有顯著臨床病理學(xué)特點及獨特基因改變的腫瘤。目前，國內(nèi)報道的EBVaGC較少。本文回顧性分析21例EBVaGC的臨床病理學(xué)特征，并結(jié)合相關(guān)文獻探討其治療及預(yù)后，以提高病理醫(yī)師對EBVaGC的認識。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年4月～2021年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院576例胃癌根治性手術(shù)標本，由兩名資深病理醫(yī)師重新復(fù)閱切片。所有病例均行EBER原位雜交檢測，篩選出EBVaGC標本21例。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫組化 所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4 μm厚切片，行HE及免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，DAB顯色，一抗包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、HER-2，購自上海羅氏公司；PD-L1購自美國Cell Signaling Technology公司；Claudin-18.2購自北京中杉金橋公司。參照試劑盒說明書操作，使用Leica全自動染色機及羅氏公司Ventana Ultra全自動免疫組化染色儀染色。

1.2.2EBER原位雜交 使用羅氏公司Ventana Ultra全自動免疫組化染色儀進行EBER原位雜交。原位雜交蛋白酶、EBER探針、原位雜交藍染染液和紅色復(fù)染劑均為羅氏工作液。參照U INFORM iVIEW Blue ISH染色程序操作。在陽性對照細胞核著色良好的情況下，腫瘤細胞核著色為深藍色記為陽性，以平均視野>5%的腫瘤細胞陽性且排除正常黏膜上皮細胞及間質(zhì)淋巴細胞陽性，歸類為EBVaGC[4]。

1.2.3FISH檢測 對HER-2免疫組化2+者加做FISH檢測，探針購自美國雅培公司，步驟參照試劑盒說明書操作。

1.3 結(jié)果判讀

1.3.1錯配修復(fù)蛋白(mismatch repair, MMR)免疫組化判讀標準 在內(nèi)對照(正常胃腺上皮及淋巴細胞等)細胞核著色良好的情況下，腫瘤細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒染色為陽性；4個蛋白均陽性為錯配修復(fù)蛋白功能正常(mismatch repair-proficient, p-MMR)，至少一種蛋白陰性則判定為錯配修復(fù)蛋白缺失(mismatch repair-deficient, d-MMR)。

1.3.2HER-2免疫組化判讀標準 0：無著色或<10%腫瘤細胞膜染色；1+：≥10%腫瘤細胞微弱或隱約可見膜染色，或僅有部分細胞膜染色；2+：≥10%腫瘤細胞有弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色；3+：≥10%腫瘤細胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強染色。參考2016版胃癌HER-2檢測指南[5]，2+者須加做FISH檢測。

1.3.3Claudin-18.2免疫組化判讀標準 根據(jù)染色程度分為4級：無細胞膜或細胞質(zhì)染色為0分，弱細胞膜或細胞質(zhì)染色為1分，中等細胞膜或細胞質(zhì)染色為2分，強細胞膜或細胞質(zhì)染色為3分。以Claudin-18.2在≥40%腫瘤細胞染色程度≥2分定義為陽性[6]。

1.3.4PD-L1免疫組化判讀標準 采用綜合陽性評分(combined positive score, CPS)[7]，即CPS=(PD-L1陽性腫瘤細胞+PD-L1陽性腫瘤相關(guān)免疫細胞)/腫瘤細胞總數(shù)×100，CPS值≥1即為PD-L1陽性，反之為陰性。

1.3.5FISH HER-2基因擴增檢測 在100倍油鏡下觀察胃癌細胞核，計數(shù)50個細胞，統(tǒng)計Ratio值，Ratio值=50個細胞核中紅信號總數(shù)/50個細胞核中綠信號總數(shù)。Ratio值<1.8為陰性；>2.2為陽性；1.8～2.2時，可以選擇增加計數(shù)細胞至100個，或重做實驗進行判讀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，一致性檢驗采用完全隨機設(shè)計χ2檢驗及多個樣本率比較的χ2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征576例胃癌中檢出EBVaGC 21例，占同期胃癌的3.6%，其中男性17例(81.0%)，女性4例(19.0%)。發(fā)病年齡42～74歲，平均61歲，中位年齡62歲；位于近端胃13例(61.9%)，遠端胃8例(38.1%)；腫瘤最大徑1.5～11 cm(表1)。

表1 EBV相關(guān)性胃癌21例臨床病理學(xué)特征

2.2 組織學(xué)特征7例(33.3%)腫瘤細胞彌漫片狀、小梁狀分布，細胞多角形、合胞樣，核空泡狀，核膜明顯，核分裂易見，間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞浸潤(圖1)；7例(33.3%)腫瘤細胞排列成腺管狀，細胞中等大小(圖2)；少數(shù)病例腫瘤細胞核被黏液推擠至一旁形成印戒細胞。Lauren分型：腸型7例(33.3%)，彌漫型4例(19.0%)，混合型2例(9.5%)，不能確定型8例(38.1%)。WHO分型：伴淋巴樣間質(zhì)的癌7例(33.3%)；其他非伴淋巴樣間質(zhì)的癌14例(66.7%)：包括管狀腺癌7例(33.3%)，低黏附性癌4例(19.0%)，混合性腺癌2例(9.5%)，未分化癌1例(4.8%)。

2.3 免疫表型及分子檢測21例EBER原位雜交均顯示腫瘤細胞核著色為深藍色(圖3、4)，其中5%

2.4 EBVaGC與non-EBVaGC臨床病理特點比較EBVaGC和non-EBVaGC在發(fā)病部位、組織學(xué)類型、Lauren分型、PD-L1 CPS評分、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。根據(jù)腫瘤細胞EBER陽性百分比將EBVaGC劃分為5%0.05)。

2.5 治療與預(yù)后21例患者均接受胃癌根治術(shù)并進行了D2淋巴結(jié)清掃，術(shù)后有8例患者行化療。2例失訪，5例死亡，14例生存，生存時間1.30～88.13個月。

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病率僅次于肺癌和結(jié)腸癌[1,9]。自1990年Burke首次報道EBV陽性胃癌以來，越來越多的證據(jù)表明，部分胃癌的發(fā)生與EBV有關(guān)[10]。雖然EBV在成人中的感染率高達90%，但在胃癌中的感染率較低。2014年TCGA分子分型中EBVaGC約占9%，其發(fā)病率在各地區(qū)及人種之間有所不同，如北美白種人中EBVaGC發(fā)病率為16%，日本為7%；國內(nèi)報道吉林省約7.6%、安徽省4.1%、北京3.9%、山東省2.1%[11-12]。本組中EBVaGC僅占比3.6%，與國內(nèi)文獻報道基本一致。目前，其地區(qū)及人種之間感染率差異的原因有待于進一步探討[13]。

EBVaGC被定義為在腫瘤細胞中檢測到EBV感染[14]，EBER原位雜交是診斷EBVaGC的金標準，但對于EBER陽性腫瘤細胞所占百分比目前尚未統(tǒng)一標準。根據(jù)腫瘤細胞EBER陽性百分比將EBVaGC劃分為5%5%)腫瘤細胞顯示EBER陽性，也可能有高的PD-L1 CPS評分和較好的預(yù)后。因此，建議對EBVaGC行PD-L1檢測并將檢測結(jié)果在報告中注明，為臨床治療提供指導(dǎo)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表2 EBV相關(guān)性胃癌與非EBV相關(guān)性胃癌性△臨床病理特征比較[n(%)]

本實驗發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC相比，其具有以下臨床病理特點：(1)好發(fā)于近端胃，平均最大徑5.5 cm。(2)Lauren分型以不能確定型最為常見，WHO分型以伴淋巴樣間質(zhì)的癌常見，但其他組織學(xué)亞型腺癌也可以檢出EBV陽性[11]。在本組21例EBVaGC中，僅1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌，僅根據(jù)組織學(xué)形態(tài)決定是否行EBER檢測可能會導(dǎo)致部分EBVaGC漏診。(3)腫瘤浸潤程度淺，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低，TNM分期早。(4)與non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS評分高(85.7%vs28.8%)，尤其在伴淋巴樣間質(zhì)的癌中PD-L1 CPS評分更高。(5)HER-2狀態(tài)：本組21例EBVaGC免疫組化及FISH檢測顯示HER-2均無過表達和擴增，而對照組non-EBVaGC(162例，1例未做)中HER-2過表達者19例(11.7%)。此外，Bermudez等[15]報道在non-EBVaGC中16%病例表現(xiàn)出HER-2擴增；另有研究顯示胃癌中HER-2過表達的發(fā)生率為13.4%[16]。上述研究表明：在EBVaGC中HER-2表達和HER-2擴增均受抑制。(6)Claudin-18.2表達：本組21例EBVaGC中Claudin-18.2陽性率47.6%。目前，我國關(guān)于Claudin-18.2在胃癌中的表達數(shù)據(jù)較少，查閱相關(guān)文獻[2,17-18]發(fā)現(xiàn)，在高加索人中EBVaGC的陽性率為77.7%，non-EBVaGC的陽性率為32.4%；在日本人群中EBVaGC的陽性率為84%，non-EBVaGC的陽性率為40%。盡管本實驗數(shù)據(jù)與文獻報道有差異(推測可能與不同抗體克隆號、不同人種及不同陽性標準有關(guān))，但Claudin-18.2在EBVaGC中的陽性率高于non-EBVaGC。此外，有學(xué)者報道在TCGA 4種分子亞型中，EBV亞型中Claudin-18.2的陽性率最高[2]。(7)4種MMR均無缺失，與文獻報道相符[19]。

目前，關(guān)于EBVaGC患者預(yù)后的研究結(jié)果不同。多項研究支持EBV感染是預(yù)后較好的因素，其中TCGA數(shù)據(jù)庫的一項研究顯示EBVaGC比其他分子亞型預(yù)后好[20]。此外，一項整合了東西方的超大樣本(375/4 244，8.2%)臨床數(shù)據(jù)也顯示EBVaGC患者的生存期更長[21-22]。然而，少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)EBVaGC與non-EBVaGC患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與以下原因有關(guān)：(1)樣本量小，一些患者尚未出現(xiàn)終點事件，刪失數(shù)據(jù)多，差異不顯著。(2)樣本內(nèi)一些患者具有特殊的分子改變，如TP53[23]、BCOR突變[24]，具有這些分子改變的患者預(yù)后差且免疫治療效果不佳。本組中19例獲得隨訪，5例患者死亡，組織學(xué)類型均為非伴淋巴樣間質(zhì)的癌，且有3例PD-L1 CPS<1，另2例PD-L1 CPS為2，生存時間1.3～51.67個月，提示在EBVaGC中組織學(xué)類型為淋巴樣間質(zhì)的癌，PD-L1 CPS評分高者常伴有良好的預(yù)后[25]。

目前，PD-L1免疫檢查點阻斷劑在治療胃癌方面發(fā)揮著越來越重要的作用。在2021年CSCO胃癌診療指南[26]中，對于HER-2擴增陰性的轉(zhuǎn)移性胃癌，PD-L1免疫治療已上升至一線治療(PD-L1 CPS≥1三級推薦，PD-L1 CPS≥5一級推薦)。有文獻報道HER-2陽性胃癌和EBVaGC之間無交叉[27]；本組21例HER-2均無擴增，提示PD-L1阻斷劑如帕博利珠單抗在胃癌(尤其是EBVaGC)治療中發(fā)揮越來越重要的作用[28-29]。

Claudin-18.2是Claudin家族的一員，是緊密連接的組成部分，可以調(diào)節(jié)細胞外屏障功能。Dottermusch等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中Claudin-18.2表達與EBV感染狀態(tài)有關(guān)，并認為腫瘤細胞中Claudin-18.2表達可能與EBV介導(dǎo)的致癌機制有關(guān)。本組21例EBVaGC中47.6%病例Claudin-18.2陽性，提示EBVaGC中Claudin-18.2高表達有望成為新的潛在治療靶點[30-31]。

綜上所述，EBVaGC是一種具有獨特臨床病理特征的胃癌，好發(fā)于男性、近端胃、TNM分期早、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低、PD-L1 CPS評分高，約1/3病例為伴淋巴樣間質(zhì)的癌。此外，與non-EBVaGC相比，EBVaGC中PD-L1 CPS評分高，Claudin-18.2陽性率高，HER-2擴增受抑制。盡管EBVaGC預(yù)后有爭議，但絕大多數(shù)文獻均支持該亞型預(yù)后好，生存時間長。PD-L1免疫檢查點阻斷劑和Claudin-18.2靶向藥的應(yīng)用，將使更多的EBVaGC患者獲益[32]。