胡飄飄，杜 華，李時(shí)榮，翁立新，海 玲，烏云嘎，徐曉艷

近年來(lái)，隨著各種測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，尋找與人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)發(fā)生發(fā)展和治療預(yù)后相關(guān)的靶基因成為研究熱點(diǎn)[1-2]。MYD88基因是一種接頭蛋白，可引起多種炎性細(xì)胞因子和抗凋亡分子的釋放[3]，其發(fā)生的致癌基因突變情況常見(jiàn)于Waldenstrom巨球蛋白血癥/淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、IgM型意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥、結(jié)外邊緣區(qū)黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病等淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中[4-7]。有文獻(xiàn)提示MYD88可能與多種B細(xì)胞腫瘤有關(guān)[8]，這些腫瘤細(xì)胞中MYD88 L265P基因突變存在功能性激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及進(jìn)展。近年發(fā)現(xiàn)DLBCL中也存在一定比率的MYD88基因突變[9]。因此，本研究檢測(cè)DLBCL中MYD88 L265P基因突變和MYD88蛋白表達(dá)情況，從組織學(xué)方面探討MYD88 L265P基因突變和MYD88蛋白表達(dá)與DLBCL發(fā)生發(fā)展及治療、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2009年1月1日～2018年12月31日內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科明確診斷的84例DLBCL石蠟包埋組織樣本及臨床病理資料?；颊咴谛辛馨徒Y(jié)活檢前均未經(jīng)放、化療等免疫治療，且均為原發(fā)。其中男性50例，49例≥60歲;結(jié)外累及63例；57例血清LDH升高(>240 U/L)；根據(jù)Hans分型法進(jìn)行分型：45例為ABC型，39例為GCB型。對(duì)84例患者通過(guò)電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪日期截至2021年2月，24例失訪。

1.2 方法

1.2.1MYD88基因突變檢測(cè) 按照石蠟包埋組織DNA提取試劑盒里說(shuō)明書(shū)提取DNA。按照2×Taq PCR Master Mix說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增DNA。用得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將合格的樣本送到北京博邁德基因公司進(jìn)行基因突變檢測(cè)。用Sanger測(cè)序法檢測(cè)MYD88 L265P基因突變情況。DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司，MYD88 L265P引物購(gòu)自上海生工公司，2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、核酸染料購(gòu)自北京博邁德公司。

1.2.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。將石蠟切片放到75 ℃烤片機(jī)上烤50 min；依次放入無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇水化；3%過(guò)氧化氫封閉10 min；熱修復(fù)20 min后自然冷卻，加一抗后4 ℃過(guò)夜，加二抗室溫放置50 min；DAB顯色，常規(guī)脫水、封固。MYD88抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，p53、c-MYC、BCL-2、BCL-6、Ki-67、CD-5、羊抗鼠/兔IgG抗體和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 結(jié)果判定用Chromas軟件分析測(cè)序圖，選出基因突變樣本。MYD88蛋白免疫組化判讀根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分，最后進(jìn)行半定量積分判定。將細(xì)胞染色范圍與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘作為最終評(píng)分：0～3分為陰性，4～9分為陽(yáng)性。其余指標(biāo)的陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)為：p53染色細(xì)胞數(shù)>50%[10]、c-MYC>40%、BCL-2>70%、BCL-6>70%、CD5>30%[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)Pearson χ2檢驗(yàn)分析MYD88與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系，當(dāng)理論頻數(shù)T<5且T≥1時(shí)，則采用連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Logistic回歸法對(duì)臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL中MYD88 L265P基因突變情況及與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系84例DLBCL患者中有22例檢測(cè)到MYD88 L265P位點(diǎn)突變(圖1)，突變率為26.19%；MYD88 L265P基因突變與Hans分型及MYD88、p53、BCL-2蛋白表達(dá)相關(guān)(P<0.05，表1)，而與其他指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性。

圖1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYD88基因L265P位點(diǎn)突變情況：A.MYD88基因L265位點(diǎn)未突變的測(cè)序圖；B.MYD88基因L265P位點(diǎn)突變的測(cè)序圖(箭頭所示：CTG→CCG)

表1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYD88 L265P基因突變與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 DLBCL組織中MYD88蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系MYD88蛋白表達(dá)定位于淋巴瘤細(xì)胞胞質(zhì)，84例DLBCL患者中MYD88蛋白陽(yáng)性33例，陽(yáng)性率39.29%，MYD88蛋白表達(dá)與Hans分型、MYD88 L265P基因突變、BCL-2蛋白表達(dá)相關(guān)(P<0.05，表2，圖2)。

表2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYD88蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

ABCDEFGH

2.3 DLBCL中MYD88基因突變與蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：DLBCL中MYD88 L265P基因突變與MYD88蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.297，P<0.006，表3)。

表3 MYD88 L265P基因突變與MYD88蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.4 MYD88蛋白表達(dá)和基因突變及其他臨床病理學(xué)因素對(duì)DLBCL生存率的影響84例患者中有60例獲得隨訪資料，其中35例死亡，25例健在。

經(jīng)患者生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，年齡≥60歲、血清LDH水平升高、MYD88蛋白陽(yáng)性、MYD88 L265P基因突變型、c-MYC蛋白陽(yáng)性、BCL-2蛋白陽(yáng)性組患者的生存率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤各臨床病理特征與患者生存率的關(guān)系：A.年齡；B.血清LDH水平；C.MYD88蛋白表達(dá)；D.MYD88 L265P基因突變；E.c-MYC蛋白表達(dá)；F.BCL-2蛋白表達(dá)

2.5 Logistic回歸分析DLBCL預(yù)后將患者年齡、性別、腫瘤部位、血清LDH水平、Hans分型、MYD88 L265P基因、MYD88、p53、c-MYC、BCL-2、BCL-6、Ki-67、CD5蛋白表達(dá)進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：年齡≥60歲、ABC型、MYD88 L265P基因突變、MYD88、BCL-2蛋白陽(yáng)性與DLBCL患者的預(yù)后有關(guān)(P<0.05，表4)。

表4 影響彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的回歸分析

3 討論

DLBCL是成人淋巴瘤中最常見(jiàn)的亞型，30%～40%的非霍奇金淋巴瘤均為DLBCL，且在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[12]。因此，尋找與DLBCL診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的靶基因是有意義和必要的。MYD88是接頭蛋白，在先天免疫反應(yīng)和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[13]。近年研究認(rèn)為MYD88突變與DLBCL相關(guān)[8-9]，因此本文對(duì)MYD88基因突變及蛋白表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系及臨床意義進(jìn)行探索。

本組84例DLBCL中MYD88 L265P基因突變率為26.19%，與大多數(shù)研究結(jié)果一致[3,14-15]。約29%的ABC型DLBCL具有MYD88 L265P基因突變[4,16-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MYD88 L265P基因突變率與p53蛋白突變型和BCL-2表達(dá)相關(guān)，但與患者年齡無(wú)相關(guān)性。而Lee等[18]認(rèn)為MYD88 L265P基因突變與患者年齡、預(yù)后及免疫分類(lèi)有關(guān)，這與本研究患者年齡的相關(guān)性不同，可能與本組樣本量較少有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MYD88 L265P基因突變與其蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，但兩者陽(yáng)性率并不完全吻合，造成此結(jié)果的原因可能是部分MYD88蛋白表達(dá)是由MYD88基因易位、融合、擴(kuò)增及其他突變點(diǎn)的改變而來(lái)。而目前只有針對(duì)MYD88 L265P基因突變的靶向藥物，因此在臨床治療時(shí)仍需做基因檢測(cè)。本研究結(jié)果(MYD88 L265P基因突變與其蛋白表達(dá)呈正相關(guān))提示MYD88免疫組化染色可對(duì)基因檢測(cè)起篩選的作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MYD88蛋白陽(yáng)性及其基因突變均與BCL-2表達(dá)水平相關(guān)，BCL-2是一種抗凋亡蛋白，以往研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、非黑色素皮膚腫瘤和女性腫瘤等[19-21]，提示MYD88可能通過(guò)BCL-2抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，也可能增強(qiáng)其他癌基因的作用并誘導(dǎo)加速腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的抵抗。MYD88通過(guò)BCL-2抑制細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制如何，還需要進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。有文獻(xiàn)報(bào)道ABC型DLBCL中MYD88蛋白表達(dá)較高[22]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ABC型DLBCL中MYD88蛋白陽(yáng)性率為27.38%，GCB型DLBCL中MYD88蛋白陽(yáng)性率為11.91%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明針對(duì)MYD88突變DLBCL的靶向藥可能為ABC型患者帶來(lái)一定希望。

有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞起源的不同與DLBCL患者生存的差異密切相關(guān)[23-24]；DLBCL患者年齡和血清LDH水平對(duì)其預(yù)后的判斷也是有效的指標(biāo)[25-26]；DLBCL預(yù)后不良與BCL-2蛋白陽(yáng)性相關(guān)[27]；BCL-2蛋白和c-MYC蛋白同時(shí)陽(yáng)性時(shí)才可以影響患者預(yù)后[28-29]。本組結(jié)果顯示，DLBCL分型、年齡和血清LDH水平可以作為判斷其預(yù)后的指標(biāo)，MYD88基因和蛋白水平都與患者預(yù)后相關(guān)，BCL-2陰性患者的生存率高于陽(yáng)性患者，而c-MYC與BCL-2對(duì)患者生存率的影響相同；回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡≥60歲、ABC型、MYD88 L265P基因突變、MYD88、BCL-2蛋白陽(yáng)性與DLBCL患者的預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。因此，用單一指標(biāo)來(lái)判斷預(yù)后存在爭(zhēng)議，可考慮將相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合判斷，以提高預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MYD88基因和蛋白水平均與患者的預(yù)后密切相關(guān)，可為判定DLBCL預(yù)后提供依據(jù)。

綜上所述，臨床病理診斷中可適當(dāng)應(yīng)用MYD88蛋白表達(dá)代替MYD88 L265P基因突變檢測(cè)，為DLBCL患者靶向治療提供便利；MYD88 L265P可能通過(guò)突變影響MYD88蛋白表達(dá)，從而影響DLBCL的發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后，為研究MYD88在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供依據(jù)。