徐 軍，陳君平，李夢君，程蘭蘭，王 健

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)已成為有EGFR敏感突變的晚期非小細胞肺癌患者一線治療的首選藥物，但大量患者表現(xiàn)出原發(fā)或獲得性耐藥和腫瘤進展，且目前仍缺乏一致且易檢測的療效、預(yù)后預(yù)測指標。WHO(2021)肺部腫瘤組織學(xué)分類中新增了國際肺癌研究協(xié)會(International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)肺腺癌分級系統(tǒng)，對肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后判斷有一定價值[1]。Napsin A是診斷肺腺癌最常用的標志物，也是早期肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后指標[2-4]。有研究報道，Napsin A表達上調(diào)可逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥肺癌細胞中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，恢復(fù)細胞對吉非替尼的敏感性[5-6]，由此設(shè)想Napsin A表達可能與EGFR-TKIs耐藥有關(guān)。本實驗主要探討晚期肺腺癌IASLC分級和Napsin A蛋白表達與EGFR-TKIs療效和患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月間解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○一醫(yī)院確診的563例肺腺癌患者，臨床分期為ⅢB～Ⅳ期，均有EGFR基因突變檢測結(jié)果，排除K-RAS和ALK陽性患者，EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs一線治療。收集患者臨床病理資料，包括患者年齡、性別、吸煙史等，按照IASLC分級系統(tǒng)(2021)進行組織學(xué)分級。同時收集EGFR-TKIs治療前后均有活檢配對的標本20對。本實驗獲得本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 基因突變擴增阻滯系統(tǒng)(ARMS法)人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物公司，所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，6～8 μm厚切片10張以上，應(yīng)用FFPE樣品DNA分類試劑盒提取DNA，將提取好的DNA稀釋成2 ng/μL，將42.3 μL稀釋好的DNA模板加入2.7 μL Taq酶液混合，分別取5 μL加入到預(yù)先分裝好的8聯(lián)管反應(yīng)液中，離心后用ABI 7500熒光定量PCR儀進行檢測，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，合計15個循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20s，合計31個循環(huán)，60 ℃收集FAM和HEX信號，進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 免疫組化及結(jié)果判定免疫組化染色采用EnVision兩步法。兔抗人Napsin A單克隆抗體購自福州邁新公司，石蠟切片脫蠟至水，其余均在BenchMark-GX全自動免疫組化儀(羅氏公司)上進行，分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。Napsin A陽性定位于細胞質(zhì)，結(jié)果判定參考Lee等[3]方法：以陽性細胞數(shù)≥10%為陽性，<10%為陰性。

1.4 療效評價隨訪及預(yù)后分析根據(jù)實體瘤的療效評價標準評價療效，分為腫瘤完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、穩(wěn)定(stable disease, SD)和進展(progressive disease, PD)。分別計算客觀緩解率(objective response rate, ORR)和疾病控制率(disease control rate, DCR)。無進展生存期(progression-free survival, PFS)定義為患者從接受治療開始至疾病進展或疾病尚未進展的末次隨訪時間。總生存期(overall survival, OS)定義為患者從接受治療開始至因任何原因死亡的時間。隨訪截至2021年9月31日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗；單因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，計算患者的PFS和OS，并繪制生存曲線；多因素分析采用Cox比例風險回歸分析預(yù)后影響因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征合計563例初治ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌患者接受了EGFR突變檢測，敏感突變257例(45.6%)，Napsin A陽性456例(81.0%)，Napsin A在EGFR敏感突變、低IASLC分級肺腺癌中的陽性率高于EGFR無突變、高IASLC分級肺腺癌。125例患者接受了EGFR-TKIs一線治療，男性48例，女性77例，中位年齡65歲，19del 60例(48%)，L858R突變55例(44%)，少見敏感突變10例(8%)，其中G719X突變5例，19del和L858R突變3例，L861Q 突變1例，L861Q和S768I突變1例；Napsin A陽性106例(84.8%)，Napsin A陽性和陰性患者的基線特征基本平衡(表1)。

表1 Napsin A表達與EGFR突變晚期肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 IASLC分級和Napsin A蛋白表達與患者療效的相關(guān)性Napsin A陽性、低IASLC分級患者的ORR明顯高于Napsin A陰性、高IASLC分級患者(P<0.001；P=0.002)，Napsin A陽性患者的DCR高于陰性患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.066，表2)。

表2 IASLC分級和Napsin A蛋白表達與患者療效的相關(guān)性

CR.完全緩解；PR.部分緩解；SD.穩(wěn)定；PD.進展；ORR.客觀緩解率；DCR.疾病控制率

2.3 影響患者PFS、OS的單因素和多因素分析Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果顯示：患者中位PFS及OS均與Napsin A表達、EGFR突變類型、IASLC分級有關(guān)，其中19del組與L858R組(P=0.003)、L858R組與少見敏感突變組(P=0.009)的中位PFS差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；19del組與L858R突變組的OS無明顯差別，但均明顯長于少見敏感突變組(P=0.028，圖1，表3)。

Cox多因素分析結(jié)果顯示：IASLC分級(P=0.02)、Napsin A表達(P=0.002)、突變類型(P=0.023)是影響患者PFS的獨立因素，同時IASLC分級(P=0.029)、Napsin A表達(P=0.007)也是影響患者OS的獨立因素(表4)，提示Napsin A表達缺失、高IASLC分級患者預(yù)后不良。

圖1 A.Napsin A表達與晚期肺腺癌患者無進展生存率的關(guān)系；B.Napsin A表達與晚期肺腺癌患者總生存率的關(guān)系；C.IASLC分級與晚期肺腺癌患者無進展生存率的關(guān)系；D.IASLC分級與晚期肺腺癌患者總生存率的關(guān)系

表3 影響EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs一線治療后PFS和OS的單因素分析

2.4 患者接受EGFR-TKIs治療前后Napsin A表達和IASLC分級變化有20對接受EGFR-TKIs一線治療前后的配對活檢標本納入研究，二次活檢結(jié)果示T790M突變9例(45.0%)。3例在EGFR-TKIs治療后出現(xiàn)Napsin A表達缺失(圖2)，這3例肺腺癌組織在EGFR-TKIs治療前為IASLC Ⅱ級，治療后均為組織學(xué)Ⅲ級，以實性成分為主，其中1例出現(xiàn)了肉瘤樣癌組織特征，且表達vimentin；3例患者中19del+T790M突變1例，L858R+T790M突變1例，其余1例未檢出T790M突變。

3 討論

盡管基于影像學(xué)和病理診斷的TNM分期是目前指導(dǎo)肺癌治療、判斷預(yù)后的主要依據(jù)，但存在明顯不足：不能精確判斷腫瘤的生物學(xué)特性，難以發(fā)現(xiàn)腫瘤更多的微觀變化等，同一TNM分期接受相同治療的患者生存?zhèn)€體差異較大，提示存在其他獨立于傳統(tǒng)TNM分期的影響預(yù)后因素。EGFR-TKIs已成為EGFR敏感突變晚期非小細胞肺癌患者一線治療的首選用藥[7]，但大量患者耐藥，繼發(fā)T790M點突變和MET基因擴增是TKIs耐藥的主要原因，然而其余機制并不清楚，探尋這些影響EGFR-TKIs療效和預(yù)后的分子標志物表達特征，有助于更好地開展肺癌的個體化治療。

表4 影響EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs一線治療后PFS和OS的多因素分析

吉非替尼治療前吉非替尼治療后?？颂婺嶂委熐鞍？颂婺嶂委熀驢ENapsin A

Napsin A常表達于肺腺癌、卵巢透明細胞癌、腎細胞癌、子宮內(nèi)膜漿液性癌、甲狀腺癌等[8-11]，肺腺癌中Napsin A陽性率為70%～90%，是診斷肺腺癌的常用抗體之一，其敏感度和特異性均高于TTF-1(83.0%vs73.0%，87.0%vs64.0%)[2]。既往研究證實Napsin A與肺腺癌患者預(yù)后有關(guān)。手術(shù)切除的肺腺癌中Napsin A陽性更多見于腫瘤直徑小、組織學(xué)類型為非實性、非黏液類型[3]、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜侵犯的患者[12]，生存分析顯示肺腺癌中Napsin A陽性患者的總體生存率高于Napsin A陰性患者[3]。相關(guān)研究多限于早期手術(shù)切除的病例，而Napsin A對晚期肺癌特別是有EGFR敏感突變并接受EGFR-TKIs治療患者的療效和預(yù)后影響研究較少。本實驗結(jié)果顯示，EGFR敏感突變晚期肺腺癌中Napsin A的陽性率為84.8%，Napsin A陽性與EGFR突變呈正相關(guān)，與克羅地亞[13]、韓國[3]、美國[14]學(xué)者研究結(jié)果基本一致，提示Napsin A表達可以作為預(yù)測患者EGFR突變狀態(tài)的分子標志物，如果Napsin A陰性，取材標本有限，則可以考慮優(yōu)先檢測EGFR之外的其它分子靶點。Napsin A陽性患者的ORR明顯高于Napsin A陰性患者，生存分析發(fā)現(xiàn)，Napsin A表達是影響患者PFS和OS的獨立因素，Napsin A表達缺失的晚期肺腺癌患者預(yù)后不良，提示Napsin A還是預(yù)測EGFR-TKIs療效和判斷患者預(yù)后的標志物。本組下一步可以進行大樣本前瞻性隨機研究，綜合更多患者的生存預(yù)后大數(shù)據(jù)，探討不同陽性界值對預(yù)后的影響，進一步明確Napsin A對臨床實施精準個體化治療的實用價值。

Napsin A在EGFR敏感突變肺腺癌中的作用機制尚不清楚。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，新近研究結(jié)果表明EMT和EGFR-TKIs耐藥有關(guān)[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)Napsin A表達水平與厄洛替尼的敏感性呈正相關(guān)，Napsin A過表達可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和由EMT介導(dǎo)的厄洛替尼耐藥[5-6]。在對吉非替尼耐藥的A549-GFT細胞中上調(diào)Napsin A表達，可通過抑制integrin信號傳導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)EMT，從而使耐藥細胞對吉非替尼重新敏感。本實驗發(fā)現(xiàn)3例患者在發(fā)生繼發(fā)耐藥后出現(xiàn)Napsin A表達缺失，其中1例未檢出T790M突變，從側(cè)面提示Napsin A可能參與了EGFR-TKIs的繼發(fā)性耐藥，耐藥后肺癌組織出現(xiàn)了低分化、肉瘤樣特征，提示該過程可能與EMT有關(guān)。本實驗的局限性在于治療前后配對樣本量偏少，上述假設(shè)仍需更多的體內(nèi)實驗研究加以印證，下一步可以探討Napsin A蛋白表達和基因改變(如基因突變、啟動子甲基化等)的關(guān)系，以及和下游信號分子、EMT相關(guān)分子標志物及integrin信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系，明確Napsin A表達缺失在EMT介導(dǎo)的EGFR-TKIs耐藥中的作用。

WHO(2021)胸部腫瘤組織學(xué)分類中新增了IASLC肺腺癌分級系統(tǒng)：Ⅰ級以貼壁樣為主，<20%高級別模式(實性、微乳頭、纖維間質(zhì)內(nèi)單個腫瘤細胞浸潤)；Ⅱ級以腺泡狀、乳頭狀為主，伴<20%高級別模式；Ⅲ級為任何組織類型伴≥20%高級別模式。以往研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織類型如實性、微乳頭狀生長方式與預(yù)后差有關(guān)，Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)不同生長模式的EGFR突變肺腺癌患者的PFS有差異。Jeon等[1]研究發(fā)現(xiàn)IASLC分級與ⅠA期肺腺癌手術(shù)切除患者的預(yù)后有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，低IASLC分級患者的ORR高于IASLC高分級患者，EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs一線治療后的中位PFS和OS均與組織學(xué)分級有關(guān)，IASLC分級是影響患者PFS和OS的獨立因素，說明IASLC分級系統(tǒng)能簡單、有效地判斷EGFR-TKIs的療效和患者預(yù)后，適宜在臨床推廣應(yīng)用。

不同EGFR突變狀態(tài)對于患者的預(yù)后價值尚無統(tǒng)一結(jié)論。單因素分析表明，19del組與L858R組(P=0.003)、L858R組與少見敏感突變組(P=0.009)的中位PFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與國內(nèi)[18]及韓國[19]部分研究結(jié)果一致。但也有一些回顧性研究結(jié)果顯示，19del組與L858R組患者的ORR和DCR差異無統(tǒng)計學(xué)意義[20]。19del組與L858R組總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明19del組與L858R組主要與患者近期療效有關(guān)，而遠期預(yù)后差異不明顯，一方面可能與OS受后續(xù)治療的影響較大有關(guān)，另一方面可能與本實驗樣本量不足有關(guān)。本實驗還納入了10例少見EGFR敏感突變患者的臨床資料，其中包括4例聯(lián)合突變的患者，這種聯(lián)合突變的靶向藥物選擇及實際療效尚缺乏足夠的病例研究。對于這類患者給予EGFR-TKIs一線治療也有一定的療效，但少見敏感突變組患者的中位PFS和OS均明顯低于常見敏感突變組。