詹鶴琴，常佳俊，袁瞻遠，姚曉荷，郝明悅，劉曉利，馬 偉，蔡永萍

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占所有成人惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%。GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)庫報告了2020年全球新發(fā)RCC 431 288例，占全球新發(fā)癌癥總數(shù)的2.2%，RCC患者死亡179 368例，占全球癌癥死亡總數(shù)的1.8%[1]。RCC早期常無明顯癥狀，約30%患者初診時已為轉(zhuǎn)移性RCC。透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC最常見的組織學亞型，占RCC的70%～80%[2]。ccRCC對常規(guī)放、化療均不敏感，外科手術(shù)是局限性和局部進展性ccRCC患者首選的治療方式，但手術(shù)后仍會發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。轉(zhuǎn)移性ccRCC患者預后較差，盡管進行了腎切除術(shù)或靶向治療，其5年生存率仍低于10%[4]。因此，探索ccRCC治療的有效新靶點，有助于了解其發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機制，對ccRCC治療及預后評估具有重要的臨床意義。

真核翻譯起始因子3(eukaryotic initiation factors 3, EIF3)是最大的、結(jié)構(gòu)最復雜的多亞基翻譯起始因子，由13個蛋白質(zhì)亞基EIF3a～EIF3m構(gòu)成[5]。EIF3亞基在腫瘤的發(fā)生和進展中起著重要作用[6]。EIF3B是EIF3關(guān)鍵的支架亞基，參與多種重要的細胞活動，包括細胞周期進程、細胞凋亡、細胞骨架組裝、翻譯調(diào)控等[7]。近年來，隨著對EIF3B認識的逐漸深入，人們對其與惡性腫瘤的關(guān)系也有了進一步認識。Zhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)EIF3B在胰腺癌中異常高表達，且與預后不良有關(guān)。有學者報道EIF3B在乳腺癌細胞株和組織中高表達，亦與患者預后差相關(guān)，而敲除EIF3B表達可抑制細胞周期和增殖[9]。目前，EIF3B在ccRCC中的作用及能否成為ccRCC治療的新靶點尚不清楚。本研究主要探討EIF3B在ccRCC及4種不同RCC細胞株中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料通過UALCAN在線網(wǎng)站分別獲得TCGA數(shù)據(jù)庫、CPTAC數(shù)據(jù)庫中正常腎組織和原發(fā)性ccRCC中EIF3B mRNA和蛋白的表達數(shù)據(jù)。TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC樣本533例，正常腎組織樣本72例；CPTAC數(shù)據(jù)庫中ccRCC樣本110例，正常腎組織樣本84例。ccRCC臨床資料包括患者年齡、性別、AJCC分期、ISUP分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(表1)。從cBioPortal數(shù)據(jù)庫中下載ccRCC EIF3B mRNA的表達數(shù)據(jù)，其中234例有完整的臨床資料信息和生存信息，用于單因素和多因素Cox回歸分析。

表1 透明細胞腎細胞癌患者的臨床病理特征[n(%)]

1.2 細胞株正常腎小管上皮細胞株HK-2和RCC細胞株Caki-2、786-O、ACHN、A-498均購自美國模式培養(yǎng)物庫(ATCC)，其中Caki-2、786-O明確為ccRCC細胞株，另兩種ACHN、A-498為RCC細胞株，未明確亞型。

1.3 主要試劑兔抗人多克隆EIF3B抗體(濃縮型)購于美國Affinity Biosciences公司；兔抗人單克隆β-actin抗體購自中國ZenBio公司；羊抗兔HRP標記二抗購自美國Signalway Antibody公司；RIPA裂解液、Maxima SYBR Green qPCR 預混液均購自美國Thermo Scientific公司；10%SDS、脫脂奶粉、Tween-20、DEPC處理水均購于上海碧云天公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液均購于美國Millipore公司；TRIzol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購于美國Invitrogen公司。

1.4 方法

1.4.1生物信息學分析 利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)在線網(wǎng)站[10]分析TCGA數(shù)據(jù)庫、CPTAC數(shù)據(jù)庫中正常腎組織和原發(fā)性ccRCC中EIF3B mRNA和蛋白的表達差異，并觀察EIF3B mRNA和蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫[11]是生存分析領(lǐng)域最經(jīng)典權(quán)威的工具，可評估30 000個基因在21種癌癥類型中的表達對生存率的影響。采用Kaplan-Meier Plotter分析EIF3B mRNA表達與ccRCC患者預后關(guān)系。從cBioPortal數(shù)據(jù)庫中下載ccRCC中EIF3B mRNA的表達數(shù)據(jù)，分析EIF3B表達水平、臨床病理特征與ccRCC患者預后的相關(guān)性。HPA數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas)[12]是基于蛋白組學、轉(zhuǎn)錄組學以及系統(tǒng)生物學數(shù)據(jù)，不僅收錄了腫瘤組織，也包含了正常組織的蛋白表達情況。利用HPA數(shù)據(jù)庫觀察EIF3B蛋白在ccRCC中的表達。

1.4.2細胞培養(yǎng) 將裝有細胞的培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，HK-2、A-498細胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，Caki-2、786-O、ACHN細胞分別使用含有10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基，觀察細胞的生長情況，每48～72 h傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3實時熒光定量PCR 細胞中的總RNA通過TRIzol試劑提取，操作按說明書進行。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Maxima SYBR Green qPCR預混液對EIF3B mRNA定量檢測，反應在ABI 7300系統(tǒng)上進行，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。EIF3B：正向引物5′-CCGGGTCAAC CTCTTTACGG-3′，反向引物5′-GAAGTGCGGTCTC CACTCTC-3′；GAPDH：正向引物5′-TGGGTGTGAAC CACGAGAA-3′，反向引物5′-GGCATGGACTGTGGT CATGA-3′，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.4.4Western blot法 使用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min后收集上清。加入SDS-PAGE上樣buffer后煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗人EIF3B抗體(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入適當稀釋的HRP標記二抗，室溫孵育1 h。將膜洗滌3次后在膜上涂布ECL發(fā)光液，在Tanon-5200成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。用兔抗人β-actin抗體(1 ∶2 000稀釋)作為內(nèi)參。

1.5 結(jié)果判定

1.5.1實時熒光定量PCR檢測結(jié)果判定 實驗重復3次，通過各樣本到達設(shè)定的閾值時所對應的擴增循環(huán)數(shù)(CT值)，采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量，比較各RCC細胞組與正常腎小管上皮細胞組間EIF3B mRNA的平均表達量。

1.5.2Western blot檢測結(jié)果判定 在Tanon-5200成像系統(tǒng)上出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的、清晰的單一條帶則為陽性。實驗重復3次，采用Image J v1.8.0軟件對條帶進行定量分析，比較各RCC細胞組與正常腎小管上皮細胞組間EIF3B蛋白的平均表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 7.00軟件進行分析并繪制箱式圖，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用方差分析；Kaplan-Meier生存分析采用Log-rank檢驗方法；應用單因素和多因素Cox回歸分析EIF3B表達水平、臨床病理特征與ccRCC患者預后的相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC和正常腎組織中EIF3B mRNA的表達利用UALCAN在線網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫ccRCC組織(533例)和正常腎組織(72例)中EIF3B mRNA的表達，結(jié)果顯示EIF3B mRNA在ccRCC中的表達水平高于正常腎組織(P<0.001，圖1A)。

2.2 ccRCC中EIF3B mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系分析EIF3B mRNA表達與ccRCC臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示：與正常腎組織相比，EIF3B mRNA在性別、年齡、AJCC分期、ISUP分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖1B～F)。

2.3 ccRCC中EIF3B mRNA表達與患者預后的關(guān)系采用Kaplan-Meier Plotter分析EIF3B mRNA表達與ccRCC患者預后的關(guān)系，結(jié)果顯示：EIF3B mRNA高表達組ccRCC患者的總體生存率低于EIF3B mRNA低表達組(HR=1.76，Log-rankP=0.000 28，圖2)。單因素Cox回歸分析顯示：AJCC分期、ISUP分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及EIF3B表達與ccRCC患者的總生存期相關(guān)(P<0.01)，而與患者性別和年齡無關(guān)。多因素Cox回歸分析顯示：AJCC分期、ISUP分級、遠處轉(zhuǎn)移及EIF3B表達是影響ccRCC患者預后的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

圖1 透明細胞腎細胞癌中EIF3B mRNA表達及與臨床病理特征的關(guān)系：A.UALCAN在線網(wǎng)站分析EIF3B mRNA在TCGA數(shù)據(jù)庫中533例透明細胞腎細胞癌組織和72例正常腎組織中的表達；B.EIF3B mRNA表達和患者性別的關(guān)系；C. EIF3B mRNA表達和患者年齡的關(guān)系；D. EIF3B mRNA表達和AJCC分期的關(guān)系；E. EIF3B mRNA表達和ISUP分級的關(guān)系；F. EIF3B mRNA表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；**P<0.01，***P<0.001

表2 影響透明細胞腎細胞癌患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析

圖2 EIF3B mRNA表達與透明細胞腎細胞癌患者總生存率的關(guān)系

2.4 ccRCC和正常腎組織中EIF3B蛋白的表達利用UALCAN在線網(wǎng)站分析CPTAC數(shù)據(jù)庫ccRCC組織(110例)和正常腎組織(84例)中EIF3B蛋白的表達，結(jié)果顯示：EIF3B蛋白在ccRCC中的表達水平高于正常腎組織(P<0.001，圖3A)。與正常腎組織相比，EIF3B蛋白在性別、年齡、AJCC分期、ISUP分級及mTOR通路分子改變亞組中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B～F)。在HPA數(shù)據(jù)庫中EIF3B抗體(HPA048983)免疫組化染色結(jié)果顯示：EIF3B蛋白在ccRCC組織中高表達，陽性信號定位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜，>75%的腫瘤細胞陽性(圖4)。

圖3 正常腎組織和透明細胞腎細胞癌中EIF3B蛋白的表達及與臨床病理特征的關(guān)系：A.利用UALCAN在線網(wǎng)站分析CPTAC數(shù)據(jù)庫110例透明細胞腎細胞癌組織和84例正常腎組織中EIF3B蛋白的表達；B.EIF3B蛋白表達和患者性別的關(guān)系；C.EIF3B蛋白表達和患者年齡的關(guān)系；D.EIF3B蛋白表達和AJCC分期的關(guān)系；E.EIF3B蛋白表達和ISUP分級的關(guān)系；F.EIF3B蛋白表達和mTOR通路相關(guān)分子改變的關(guān)系；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖4 HPA數(shù)據(jù)庫中EIF3B抗體(HPA048983)免疫組化染色顯示：EIF3B蛋白在透明細胞腎細胞癌組織中高表達，陽性信號定位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜，>75%的腫瘤細胞陽性

2.5 RCC細胞和正常腎細胞株中EIF3B mRNA的表達實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：與正常腎小管上皮細胞HK-2組相比，4種不同RCC細胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498組中EIF3B mRNA的相對表達量均增高，其中ccRCC細胞Caki-2、786-O組中的表達更高(t=10.92，P=0.000 4；t=12.7，P=0.000 2，圖5)。

圖5 實時熒光定量PCR檢測EIF3B mRNA在正常腎小管細胞HK-2和4種不同腎細胞癌細胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中的表達：***P<0.001

2.6 RCC細胞和正常腎細胞株中EIF3B蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示：EIF3B蛋白在正常腎小管細胞HK-2中低表達，而在4種RCC細胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中均高表達，其中ccRCC細胞Caki-2、786-O表達更高(t=14.36，P=0.000 1；t=13.24，P=0.000 2，圖6)。

圖6 Western blot法檢測EIF3B蛋白在正常腎小管細胞HK-2和4種不同腎細胞癌細胞Caki-2、786-O、ACHN、A-498中的表達：**P<0.01；***P<0.001

3 討論

近年來，ccRCC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。ccRCC對常規(guī)放、化療均不敏感，且約1/3患者在就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此在治療上仍面臨較大挑戰(zhàn)。目前，免疫檢查點抑制劑已成為ccRCC患者一個新的治療選擇。盡管這種新興療法可在一定程度上提高患者的存活率，但仍有大量晚期ccRCC患者對這一治療無反應或出現(xiàn)耐藥[13]。因此基于ccRCC發(fā)病的分子機制，探尋新的預后指標和治療靶點，對ccRCC患者的預后判斷及治療具有重要的臨床意義[14]。

人類EIF3B蛋白是一種主要的支架蛋白，由814個氨基酸組成，在N端具有RNA識別結(jié)構(gòu)域(RRM)[15]。EIF3B通過調(diào)控mRNA的翻譯起始過程、從而影響蛋白質(zhì)的合成，最終能夠調(diào)控細胞的生長。近年有研究表明，EIF3B對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[8-9,16-18]。Tian等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EIF3B可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，并與非小細胞肺癌患者的疾病進展和預后相關(guān)。沉默EIF3B表達可降低骨肉瘤細胞的活性，增加骨肉瘤細胞的凋亡水平，并通過靶向調(diào)控TNFRSF21促進骨肉瘤細胞的增殖[17]。Wang等[18]研究表明，抑制EIF3B表達可抑制卵巢癌細胞的增殖，增加卵巢癌細胞的凋亡。目前，EIF3B在ccRCC中作用的研究極少，僅1篇文獻報道EIF3B在ccRCC中高表達[19]，EIF3B能否成為ccRCC預后的新指標及治療的新靶點尚不清楚。

本研究利用UALCAN在線網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫ccRCC和正常腎組織中EIF3B mRNA的表達，結(jié)果顯示EIF3B mRNA在ccRCC中表達增高；且與正常腎組織相比，EIF3B mRNA在性別、年齡、AJCC分期、ISUP分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組中的表達升高。CPTAC數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，EIF3B蛋白在ccRCC中的表達水平高于正常腎組織；EIF3B蛋白在性別、年齡、AJCC分期、ISUP分級亞組中的表達也高于正常腎組織。同時，HPA數(shù)據(jù)庫亦證實EIF3B蛋白在ccRCC組織中高表達。上述結(jié)果提示：EIF3B可能在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CPTAC數(shù)據(jù)庫顯示：110例ccRCC中有105例(95.5%)存在mTOR通路相關(guān)分子的改變，且105例存在mTOR分子改變的ccRCC中EIF3B的表達高于正常腎組織，提示EIF3B在ccRCC中可能通過mTOR信號通路發(fā)揮作用。此外，單因素Cox回歸分析顯示，ccRCC患者AJCC分期、ISUP分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及EIF3B表達與患者的總生存期相關(guān)，而與患者性別和年齡無關(guān)；多因素Cox回歸分析顯示，AJCC分期、ISUP分級、遠處轉(zhuǎn)移及EIF3B表達是影響ccRCC患者預后的獨立危險因素。Kaplan-Meier Plotter分析結(jié)果顯示：EIF3B表達對ccRCC患者的總體生存率有影響。EIF3B高表達組ccRCC患者的總體生存率低于EIF3B低表達組，提示EIF3B高表達與ccRCC患者預后不良相關(guān)。

為進一步探索EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC中的表達水平，本組選用了4種不同RCC細胞株Caki-2、786-O、ACHN和A-498(其中Caki-2、786-O明確為ccRCC細胞株)和正常腎小管上皮細胞株HK-2。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，EIF3B mRNA在4種RCC細胞中的相對表達量均高于HK-2細胞，其中Caki-2、786-O表達更高。Western blot結(jié)果顯示，EIF3B蛋白在4種RCC細胞中的表達量增高，尤其是ccRCC細胞Caki-2和786-O。Zang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，EIF3B蛋白在Caki-2和A-498中高表達。本組結(jié)果提示：EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC細胞株中的表達水平與在ccRCC組織中的表達一致，均呈高表達。

綜上，EIF3B mRNA和蛋白在ccRCC組織及細胞株中均呈高表達，且與ccRCC臨床病理特征及預后相關(guān)，并且存在mTOR信號通路分子改變的ccRCC中EIF3B表達增高，提示EIF3B在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并可能通過mTOR信號通路發(fā)揮其作用。該結(jié)果為進一步深入研究ccRCC的分子機制、探尋新的預后指標和治療靶點提供一定的理論依據(jù)。