黃廣麗 李軍勤 李杰 趙麗靜 張秀芳

20世紀(jì)50年代各國開展大規(guī)模的百日咳疫苗接種，百日咳發(fā)病率、病死率明顯降低，然而據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)全球仍有上千萬患兒，百日咳仍是全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。我國百日咳疫苗覆蓋率較高，然而近年來我國百日咳發(fā)病率仍有升高，且有報(bào)道顯示個(gè)別地區(qū)有暴發(fā)流行現(xiàn)象[2-3]。百日咳是由百日咳鮑特菌、副百日咳鮑特菌引起的高度傳染性急性呼吸道疾病[4]。0～4歲嬰幼兒是百日咳發(fā)病率、病死率最高的人群，其中1歲以內(nèi)患兒病死率高達(dá)60%，嚴(yán)重威脅嬰幼兒生命健康[5]。百日咳早期診斷主要依賴患兒臨床癥狀，但易發(fā)生不典型病例的誤診、漏診，因此，實(shí)驗(yàn)室檢測是該病診斷的重要依據(jù)。細(xì)菌培養(yǎng)法是診斷百日咳的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然其特異度較高，但其靈敏度易受外界因素的影響，且不宜標(biāo)準(zhǔn)化。應(yīng)用ELISA法定量檢測抗百日咳毒素IgG抗體（PT-IgG）靈敏度、特異度均較高，但人體在接種疫苗后或急性期的患兒則無法檢出且對(duì)其他鮑特菌、副百日咳鮑特菌缺乏診斷價(jià)值[6]。裂隙淋巴細(xì)胞存在于百日咳患兒外周靜脈血中，基于ELISA法的不足與裂隙細(xì)胞的特點(diǎn)，本研究將裂隙淋巴細(xì)胞與血細(xì)胞檢測進(jìn)行聯(lián)合，探討本病合理的診斷方法。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年1月至2021年6月邯鄲市婦幼保健院收治的疑似百日咳患兒108例為研究對(duì)象，其中男55例，女53例；年齡1～3（2.03±0.04）歲。根據(jù)百日咳桿菌核酸檢測結(jié)果，分為觀察組（百日咳桿菌核酸檢測結(jié)果陽性）68例和對(duì)照組（百日咳桿菌核酸檢測結(jié)果陰性）40例。觀察組患兒男38例，女30例；年齡1～3（2.02±0.03）歲；對(duì)照組患兒男21例，女19例；年齡1～3（1.09±0.03）歲；兩組患兒性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜5歲的住院患兒；（2）有上呼吸道癥狀需要鑒別診斷者；（3）陣發(fā)性、痙攣性咳嗽、咳嗽后伴發(fā)嘔吐，存在呼吸暫停癥狀，雞鳴樣吸氣性回聲，結(jié)膜下出血，舌系帶潰瘍。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近3個(gè)月有咳嗽、哮喘等癥狀；（2）存在自身免疫功能缺陷者；（3）氣道畸形、先天性心血管畸形等引起的咳嗽癥狀者；（4）過敏性氣道非特異性炎癥，或存在明確病原菌所致的毛細(xì)支氣管炎、氣管炎等；（5）腫瘤、異物、淋巴結(jié)腫大等所致氣道受壓而引起的咳嗽者；（6）咽喉壁膿腫、會(huì)咽炎、腺樣體肥大等胸腔外氣道疾病者；（7）心、肝、腎等重要器官嚴(yán)重功能障礙者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 百日咳桿菌核酸檢測 采用熒光PCR法。于患兒入院當(dāng)天收集深部痰液，使用百日咳桿菌核酸測定試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）測定百日咳桿菌核酸是否陽性。陽性判定：熒光PCR法檢測到核酸序列即為陽性。

1.2.2 裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測 于患兒入院當(dāng)天采集外周靜脈血2 ml，將患兒血液進(jìn)行手工推片制備合格血涂片2～3張，進(jìn)行瑞氏染色。由有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)100個(gè)有核細(xì)胞中裂隙淋巴細(xì)胞所占比例。裂隙淋巴細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)：細(xì)胞圓形、胞體較小，胞質(zhì)量少、染色深，清透、無顆粒，細(xì)胞核型不規(guī)則、染色質(zhì)濃縮且致密，細(xì)胞核可表現(xiàn)為對(duì)稱的雙核或分葉狀、核仁缺失，或見深淺不等的切跡、裂縫。陽性判定：外周靜脈血涂片中存在裂隙淋巴細(xì)胞即為陽性。

1.2.3 WBC及淋巴細(xì)胞百分比檢測 于患兒入院當(dāng)天采集外周靜脈血2 ml，使用SysmexXE-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測WBC及淋巴細(xì)胞百分比。陽性判定：WBC＞12×109/L、淋巴細(xì)胞百分比＞50%即為陽性。

1.2.4 PT-IgG檢測 采用ELISA法。于患兒入院當(dāng)天采集外周靜脈血2 ml，并進(jìn)行血清分離，保存于-20℃環(huán)境下，待檢。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行抗體檢測，陽性判定：超過同年齡組健康兒童百日咳特異性抗體檢測結(jié)果均數(shù)＋2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差者即為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。方差不齊的計(jì)量資料以表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；兩組性別的差異及不同指標(biāo)間靈敏度與特異度比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒鏡下裂隙淋巴細(xì)胞形態(tài) 108例患兒中，42例患兒血涂片中可見數(shù)量不等的裂隙淋巴細(xì)胞。顯微鏡下可見細(xì)胞質(zhì)呈淺藍(lán)色透亮狀或藍(lán)色，且數(shù)量較少，無核仁；細(xì)胞體積小，圓形，染色較深且胞質(zhì)量少；細(xì)胞核染色質(zhì)聚集為深紫色且可見明顯裂隙，該裂隙貫穿于整個(gè)細(xì)胞，表現(xiàn)為不對(duì)稱雙核樣或雙核樣。

2.2 兩組患兒裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、WBC、淋巴細(xì)胞百分比、PT-IgG水平比較 觀察組患兒裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、WBC、淋巴細(xì)胞百分比、PT-IgG水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

表1 兩組患兒裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、WBC、淋巴細(xì)胞百分比、PT-IgG比較

2.3 不同指標(biāo)靈敏度與特異度比較 108例患兒中，裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)陽性42例、WBC陽性63例、淋巴細(xì)胞百分比陽性71例、PT-IgG陽性14例。裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)靈敏度為 0.588（40/68），特異度為 0.950（38/40）；WBC靈敏度為0.809（55/68），特異度為0.800（32/40）；淋巴細(xì)胞百分比靈敏度為0.838（57/68），特異度為0.650（26/40）；PT-IgG靈敏度為0.192（13/68），特異度為0.975（39/40），見表2。裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)特異度高于WBC、淋巴細(xì)胞百分比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.31、30.04，均P＜0.05），而靈敏度均低于前兩者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.72、22.41，均P＜0.05）。裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與PT-IgG特異度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.35，P＞0.05）。

表2 不同指標(biāo)陽性情況（例）

3 討論

百日咳主要通過飛沫經(jīng)呼吸道傳播，以人體為主要宿主，其高發(fā)人群為嬰幼兒[7]。近年來百日咳發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，有學(xué)者提出“百日咳再現(xiàn)”[8]，且隨著百日咳疫苗的應(yīng)用，患兒臨床表現(xiàn)不典型，給該病的早期診斷帶來困難，易發(fā)生漏診、誤診，而延誤治療則會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率、病死率的升高[9]。目前，關(guān)于百日咳的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病原學(xué)、血清百日咳毒素檢測、鼻咽拭子[10-13]。細(xì)菌培養(yǎng)是百日咳診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法檢測周期長，且百日咳存在1～2周潛伏期，導(dǎo)致其在基層醫(yī)院開展困難，因此，探討簡便、快捷、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測方法是控制傳染的關(guān)鍵。

本研究顯示，觀察組患兒WBC、淋巴細(xì)胞百分比、PT-IgG水平均明顯高于對(duì)照組。百日咳毒素能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、提高白細(xì)胞水平的免疫效應(yīng)，因此百日咳患兒的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果可見WBC、淋巴細(xì)胞異常[14-16]。雖然，淋巴細(xì)胞增多是百日咳的重要檢測特征，但從本研究來看，淋巴細(xì)胞在百日咳患兒中的特異度較低。Qing等[17]研究顯示，裂隙淋巴細(xì)胞由百日咳毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生，從本研究來看裂隙淋巴細(xì)胞特異度明顯高于WBC、淋巴細(xì)胞百分比，這與Qing等[17]研究結(jié)果一致。有學(xué)者指出，從外周靜脈血涂片中讀取裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是快速、簡單的百日咳診斷方法[18]。本研究顯示，裂隙細(xì)胞在鏡下有明顯的形態(tài)特征，易辨識(shí)，且外周靜脈血取樣、觀察簡單易行，適合在基層醫(yī)院開展。史海燕[19]對(duì)100例疑似百日咳病患兒進(jìn)行百日咳毒素IgG抗體檢測，結(jié)果顯示抗體陽性率為22%，說明抗體檢測的靈敏度不高，若單純依靠抗體檢測容易漏診。

綜上所述，結(jié)合百日咳臨床表現(xiàn)，當(dāng)患兒外周靜脈血WBC、淋巴細(xì)胞百分比升高，且觀察到裂隙淋巴細(xì)胞時(shí)應(yīng)高度懷疑百日咳。在未獲得細(xì)菌培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果時(shí)，注重顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化對(duì)百日咳早期篩查具有重要意義。鑒于有報(bào)道指出，裂隙淋巴細(xì)胞可見于白血病、淋巴瘤患者外周靜脈血中[20]，故不能將裂隙淋巴細(xì)胞作為百日咳的單一診斷依據(jù)。本研究顯示裂隙淋巴細(xì)胞陽性的40例患兒中有38例確診百日咳感染，特異度為0.950，再次證明裂隙淋巴細(xì)胞出現(xiàn)與百日咳感染有關(guān)，可作為百日咳的特異性指標(biāo)，考慮到裂隙淋巴細(xì)胞靈敏度低于特異度的特點(diǎn)，在臨床實(shí)驗(yàn)室診斷中可將裂隙淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與WBC、淋巴細(xì)胞百分比相結(jié)合，采取3者聯(lián)合診斷策略，以提高百日咳診斷的準(zhǔn)確性。外周靜脈血涂片觀察裂隙淋巴細(xì)胞聯(lián)合血細(xì)胞檢測對(duì)百日咳診斷具有縮短診療時(shí)間、節(jié)約醫(yī)療成本的積極意義。