趙丹妮，吳貝貝，吐爾洪·買買提?

(1.新疆大學 化學學院 省部共建碳基能源資源化學與利用國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017；2.中國石油化工股份有限公司 西北油田分公司工程技術研究院，新疆 烏魯木齊 830000)

0 引言

化妝品已成為人們?nèi)粘Ｉ钪械谋匦杵分唬滟|(zhì)量安全問題備受關注．我國《化妝品安全技術規(guī)范（2015年版）》[1]中明確列出了化妝品限用組分（47項）和禁用組分（1 388項），其中局部麻醉藥（Local Anesthetics,LAs）、抗生素類、非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和性激素等均為化妝品原料中的禁用組分，若摻雜這些成分的產(chǎn)品被人們長期使用，會導致皮膚產(chǎn)生不良反應，如皮膚萎縮、紅斑和瘀點等[2]．其中LAs是在保持意識清醒的情況下，引起可逆的局部組織痛覺消失，在臨床醫(yī)用和治療各種急性、慢性疼痛癥狀中不可或缺．然而，LAs的過量或不當使用都會使人產(chǎn)生中毒反應[3?5]，因此在我國LAs是化妝品中禁用的組分．為保護消費者的安全，建立可靠的化妝品中禁用組分檢測分析方法是非常必要的．為對化妝品中LAs組分進行有效的萃取和富集，選擇優(yōu)良的吸附填料也極為重要．目前商品化填料眾多，如硅膠基質(zhì)、無機基質(zhì)和離子交換基質(zhì)材料等，但這些填料的吸附作用相比分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers,MIPs）選擇性不高．

分子印跡技術（Molecular Imprinting Technique,MIT）因具有對分析物提供強大的分子識別功能而受到廣泛關注．MIPs是基于MIT制備的一種具有預定分子識別特性的高分子化合物，可實現(xiàn)對模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物選擇性識別和結(jié)合[6]．由于MIPs具有結(jié)構(gòu)可預見性、識別特異性、應用廣譜性、理化穩(wěn)定性、重復性和低成本等優(yōu)點，被廣泛應用于生物、環(huán)境和食品樣品中目標物的提取與純化，并發(fā)展為分子印跡固相萃取（MISPE）[7]．本文以布比卡因為模板分子制備MIPs，將其作為填料，采用共燒結(jié)法制備了吸頭整體柱，結(jié)合GC-MS建立了化妝水中5種LAs的分離分析方法．

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

試劑：鹽酸布比卡因、二甲基丙烯酸乙二醇酯、甲基丙烯酸、鹽酸普魯卡因均購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，丁卡因、苯佐卡因、鹽酸普魯卡因胺、偶氮二異丁腈均購自北京百靈威科技有限公司，利多卡因購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，二氯甲烷購自國藥集團化學試劑有限公司，甲苯購自成都科隆化學品有限公司；上述試劑均為分析純．甲醇和乙腈購自美國SIGMA公司，均為HPLC級別；超高分子量聚乙烯購自東莞安特生物技術有限公司．

材料：化妝水由烏魯木齊食品藥品監(jiān)督管理局提供．MCX小柱和C18小柱購自上海安譜實驗科技股份有限公司，HLB小柱購自上海楚定分析儀器有限公司．

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（5977A/7890B，安捷倫科技有限公司）、液相色譜（LC-20AD，日本島津公司）、傅里葉變換紅外光譜儀（EQUINOX 55，德國布魯克公司）、掃描電子顯微鏡（SU 8010，日本日立公司）、超純水儀（UPT-1-10T，成都優(yōu)普儀器設備有限公司）、電子分析天平（BS210S，北京賽多利斯公司）、SPE裝置（HX-SPE 12，武漢恒信世紀科技有限公司）、pH計（FE-28，上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）、離心機（HC-2062，安徽中科中佳科學儀器有限公司），吸頭購自上海泰坦科技股份有限公司．

1.3 實驗方法

1.3.1 儲備液的制備

鹽酸布比卡因儲備液：稱取0.025 0 g鹽酸布比卡因于25 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，制得1 000 mg·L?1鹽酸布比卡因儲備液，4℃保存．取出0.1 mL儲備液于10 mL容量瓶中，用一定比例乙腈/水定容，制得工作溶液．

丁卡因儲備液：稱取0.025 0 g丁卡因于25 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成濃度為1 000 mg·L?1的丁卡因儲備液．

混合LAs標準儲備液：稱取鹽酸普魯卡因胺、利多卡因各0.050 0 g或鹽酸普魯卡因、苯佐卡因、布比卡因各0.040 0 g于50 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻備用，配制成濃度為1 000 mg·L?1和800 mg·L?1的混合LAs儲備液．

1.3.2 布比卡因游離堿的制備

布比卡因游離堿的制備參照文獻[8]，取鹽酸布比卡因（1.000 g）溶于80 mL水中，超聲溶解，制成水溶液，將其過濾濾液用飽和Na2CO3將pH值調(diào)至11.00，使其沉淀完全，將其完全轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加二氯甲烷進行萃取（3×30 mL），收集下層溶液，再加入適量無水硫酸鈉進行干燥，過濾后收集溶液于圓底燒瓶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓蒸發(fā)，得到布比卡因游離堿（即布比卡因），室溫保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.3 布比卡因MIPs的制備

將布比卡因（0.67 mmol，192.300 0 g）作為模板分子，溶解在11.50 mL無水甲苯中，加入功能單體甲基丙烯酸（8.20 mmol，0.705 9 g），超聲5 min使其混勻．再加入交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯（44.10 mmol，9.915 0 g）和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（0.48 mmol，0.079 0 g），超聲10 min，通氮氣5 min以去除聚合物瓶中的氧氣，在氮氣氣氛下立即密封，紫外燈（6×8 W，365 nm）15℃下聚合24 h，最后得到白色的整體硬質(zhì)聚合物，將其進行研磨，過篩（38～75μm），用甲醇進行索氏提取洗去模板分子和未反應的單體，收集聚合物顆粒，用甲醇進行沉降以去除細小的顆粒．最后聚合物顆粒在60℃下干燥備用．非分子印跡聚合物（NIPs）的制備除了不加模板分子，其它條件與MIPs制備條件一致．

1.3.4 共燒結(jié)法制備吸頭整體柱SPE裝置

共燒結(jié)法制備吸頭整體柱的方法與本課題組前期工作一致[9]．將200μL吸頭尖端熱封得到吸頭填充柱，調(diào)整吸頭接口為注射器的適配接口，將MIPs填料和粘結(jié)劑（超高分子量聚乙烯）以40/60（w/w）混合裝入吸頭內(nèi)部，吸頭內(nèi)混合粉末總質(zhì)量為40 mg（16 mg MIPs填料，24 mg粘結(jié)劑），準確控制溫度至150℃，于加熱模塊共燒結(jié)30 min，冷卻后取出將封閉的尖端去除，即得吸頭整體柱SPE裝置，室溫儲藏備用．

1.3.5 樣品處理及SPE凈化過程

化妝水處理過程：稱取1.000 0 g化妝水于試管中，添加5 mL乙腈，渦旋振蕩5 min，超聲提取10 min，4 000 r·min?1離心5 min后，取上清液于50 mL容量瓶中，以磷酸緩沖液（pH=9.00）定容，過0.22μm濾膜，室溫儲藏備用．

吸頭整體柱用3 mL甲醇活化，1 mL化妝水樣品上樣，3 mL水淋洗，1 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜，進行GC-MS檢測．

1.3.6 檢測條件

HPLC：色譜柱為Waters XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）．流動相A為乙腈，流動相B為pH=6.80的磷酸緩沖液，A和B的比例（65/35，v/v）固定．檢測波長為230 nm，流速為1.0 mL·min?1，進樣量為20μL[10]．

GC：色譜柱為DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）．儀器參數(shù)設定為進樣口溫度280℃，載氣為He，線速度為44.0 cm·sec?1，進樣量為1μL，不分流進樣，0.5 min后打開分流閥，分流比為5︰1；升溫程序為初始溫度120℃保持1 min，并以10℃·min?1升至280℃，保持12 min[11]．

MS：電子轟擊離子源，離子源溫度為200℃，電子能量為70 eV，電子倍增器電壓為0.70 kV，傳輸線溫度為250℃，掃描模式為選擇離子掃描（SIM）[11]．

1.3.7 計算公式

式中：R為回收率，E為吸附率．Celu為洗脫液中目標分析物的濃度；Ce為上樣溶液流經(jīng)吸頭后溶液中目標分析物的濃度；Caq為上樣溶液中目標分析物的濃度；單位均為mg·L?1．Vaq為上樣溶液的體積，Velu為洗脫溶液的體積；單位均為L．

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR光譜表征

FTIR光譜廣泛應用于物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)分析．對合成的MIPs、NIPs、模板分子以及含有模板分子的MIPs進行了表征，結(jié)果如圖1所示．1 631 cm?1處為C=C的伸縮震動峰，聚合液中存在大量具有雙鍵結(jié)構(gòu)的功能單體、交聯(lián)劑，但此處的吸收峰明顯較小，表明功能單體（甲基丙烯酸）和交聯(lián)劑（二甲基丙烯酸乙二醇酯）發(fā)生了聚合反應；1 230 cm?1處為苯環(huán)C-H骨架彎曲振動峰，對比圖1（a～d）發(fā)現(xiàn)，僅含有模板分子的MIPs和模板分子顯示該峰，而MIPs曲線上并未出現(xiàn)，表明圖1（c）中含有模板分子，而圖1（b）中不含模板分子；洗去模板分子的MIPs和NIPs的FTIR譜圖相似，說明模板分子被去除，可用于后續(xù)實驗．

圖1 FTIR譜圖

2.2 分子印跡聚合物整體柱吸附性能的表征

2.2.1 吸附選擇性

吸附選擇性是考察MIPs的重要指標．選擇利多卡因、鹽酸普魯卡因、苯佐卡因、鹽酸普魯卡因胺為布比卡因的結(jié)構(gòu)類似物，分析了MIPs對布比卡因的吸附選擇性．由圖2（a）可知，MIPs對其具有良好的特異性吸附作用，同時利多卡因、鹽酸普魯卡因胺、苯佐卡因、鹽酸普魯卡因的結(jié)構(gòu)與布比卡因具有相似性，易于嵌入MIPs孔穴與結(jié)合位點上的羧基形成氫鍵，從而具有相似的結(jié)合性能．因此，制備的MIPs可用于布比卡因及其結(jié)構(gòu)類似物的吸附．

圖2 布比卡因MIPs整體柱吸附性能分析

2.2.2 與商品化填料對比

為評價MIPs與商品化填料萃取性能的差異，將商品化填料HLB、MCX、C18與粘結(jié)劑通過共燒結(jié)制備的吸頭整體柱與MIPs制備的整體柱進行對比．HLB填料表面鍵合了不同的官能團，吸附過程中對極性和非極性化合物均有保留作用；MCX填料具有分析物與吸附劑之間的離子交換作用及反向保留作用，且MCX填料在極端pH下仍具有較好的穩(wěn)定性，對強極性化合物具有較好的萃取效果；C18填料具有疏水作用，對非極性化合物具有較好的萃取作用．由圖2（b）可知，MIPs整體柱與商品化SPE填料（HLB）的萃取效果相近，萃取效果為HLB>MIPs>MCX>C18．

2.2.3 吸頭整體柱批內(nèi)批間重現(xiàn)性

3批次同樣條件下，每次共燒結(jié)制備了5根吸頭整體柱，以分析共燒結(jié)方法制備的同一批次和不同批次吸頭整體柱的萃取性能差異．由圖2（c）可知，批內(nèi)的RSDs（n=5）為1.15%，批間的RSDs（n=3）為1.29%，表明批內(nèi)與批間的整體柱均具有較好的制備重現(xiàn)性，可用于后續(xù)實驗．

2.2.4 吸附重復性

對MIPs進行了重復吸附及再生，測試了MIPs的重復使用性能．由圖2（d）可知，制備的MIPs在使用7次后，依然具有較好的吸附性能，表明MIPs具有良好的重復性，這對節(jié)約成本、提高使用效率具有較大的實際意義．

2.3 SPE條件優(yōu)化

2.3.1 上樣溶劑

為探究MIPs和NIPs對布比卡因的結(jié)合能力，以吸附量及印跡指數(shù)（IF）為指標，分析了不同比例的乙腈/水溶劑對其吸附作用的影響，印跡指數(shù)為MIPs對布比卡因的吸附量與NIPs對布比卡因的吸附量之比．由圖3（a）可知，對比不同比例的乙腈/水對MIPs和NIPs吸附量的影響，發(fā)現(xiàn)MIPs的吸附容量遠大于NIPs，即MIPs中存在大量與模板分子相匹配的印跡空穴，相比NIPs表現(xiàn)出更好的吸附行為．當乙腈/水為20/80（v/v）時，MIPs的IF最高（3.53）．為進一步分析乙腈/水在20/80（v/v）比例附近對MIPs吸附率的影響，對10/90、20/80比例進行了對比，由圖3（b）可知，兩個比例對MIPs吸附率的影響并不顯著，但隨乙腈含量升高吸附率略有下降，因此選擇乙腈/水（10/90，v/v）作為上樣溶劑用于下一步實驗．

圖3 MISPE條件的優(yōu)化

2.3.2 上樣溶液pH

SPE過程中溶液pH影響著分析物的狀態(tài)，因此分析了不同pH（5.00～11.00）對萃取效率的影響，結(jié)果如圖3（c）所示．pH在5.00～9.00范圍內(nèi)，吸附率逐漸升高；pH在9.00～11.00范圍內(nèi)，萃取效率呈下降趨勢，這可能是由于pH增加，布比卡因形成脫質(zhì)子形式[12]．故選擇pH為9.00進行下一步實驗．

2.3.3 洗脫溶劑

SPE過程中洗脫溶劑的選擇至關重要，須確保分析物從填料中盡可能多地洗脫下來以獲得較高的回收率．分別以二氯甲烷和甲醇作為洗脫溶劑對其洗脫能力進行分析，由圖3（d）可知，當洗脫溶劑為甲醇時其回收率優(yōu)于二氯甲烷，目標分析物能從填料中更好地洗脫下來，故選擇甲醇為洗脫溶劑用于后續(xù)實驗．

2.4 SPE與GC-MS聯(lián)用對化妝水樣品的測定

2.4.1 方法的建立及評價

在1.3.6節(jié)的GC-MS實驗條件下，以丁卡因（5.0 mg·L?1）為內(nèi)標物，對5種化合物進行了分析，總離子流圖如圖4所示，該條件下得到了較好的分離效果，GC-MS選擇離子監(jiān)測表（SIM）見表1．

圖4 混合標準溶液的總離子流圖

表1 GC-MS選擇離子監(jiān)測表（SIM）

從線性范圍、相關系數(shù)、LODs、LOQs對本文建立的方法進行驗證．制備0.5～50.0 mg·L?1（利多卡因和鹽酸普魯卡因胺）和0.4～40.0 mg·L?1（苯佐卡因、鹽酸普魯卡因和布比卡因）范圍內(nèi)的7個濃度的標準曲線．以5.0 mg·L?1的丁卡因為內(nèi)標物，對分析物與內(nèi)標物響應值之比y、分析物與內(nèi)標物濃度之比x進行線性關系分析，結(jié)果見表2．5種LAs在一定范圍內(nèi)線性關系良好，可用于定量分析．

表2 GC-MS方法學參數(shù)

為檢測化妝水中的5種LAs，將化妝水及加入標準物質(zhì)的樣品按照1.3.5節(jié)的方法進行預處理，GC-MS檢測吸頭整體柱SPE后的洗脫液，結(jié)果見表3，除鹽酸普魯卡因胺外，其它分析物的回收率為76.58%～121%，RSDs＜8.06%．

表3 化妝水中5種LAs的加標回收率與RSDs值（n=3）

2.4.2 實際樣品的測定

化妝品成分復雜，樣品中含有的基質(zhì)較多．對比圖5經(jīng)SPE處理前后化妝水樣品HPLC圖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SPE處理后化妝水樣品中雜質(zhì)含量相對減少．由圖6（a）可知，經(jīng)PT-SPE前處理后的樣品中除了丁卡因（內(nèi)標物）外，其它5種LAs均未檢出．由圖6（b～c）可知，在不同的加標濃度下，目標分析物均可檢出，雜質(zhì)峰很少，得到了“干凈”的譜圖，表明該整體柱具有較好的凈化作用．

圖5 化妝水樣品經(jīng)吸頭整體柱處理前（a）和處理后（b）的HPLC圖

圖6 經(jīng)吸頭整體柱處理后的洗脫液總離子流圖

2.4.3 方法對比

將本文建立的方法與其它測定實際樣品中LAs的分析方法從樣品基質(zhì)、檢測儀器、線性范圍、回收率和LOQs等方面進行對比，結(jié)果見表4．本文方法獲得了較好的回收率并具有相對較低的LOQs，且對比行業(yè)標準《法庭科學生物檢材中利多卡因、羅哌卡因和布比卡因檢驗氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜法（GA/T 1613―2019）》[13]中采用的固相萃取方法對洗脫液通過GC-MS進行測定，其檢出限與本文方法的檢出限相近，且本文制備的整體柱可替代較昂貴的進口HLB小柱并具有較低的傳質(zhì)阻力，使整個分析過程經(jīng)濟、綠色，為實際樣品中含有此類分析物提供了一種可參考的樣品前處理方法．

表4 本文建立的方法與其它方法萃取和檢測LAs的對比

3 結(jié)論

以分子印跡聚合物吸頭整體柱固相萃取結(jié)合GC-MS，建立了一種化妝水中5種LAs的檢測方法．該方法前處理簡便快捷、易于操作，凈化效果好，目標分析物回收率高且具有較高的準確性．該PT-SPE整體柱具有較好的凈化作用，提高了對目標物的識別能力．為化妝水中LAs的監(jiān)控提供了一種靈敏度高、選擇性好的分析方法，具有較高的應用價值和前景．