牟復(fù)美，高如宏，廉鳳霞，馬文禮，張小蘭

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750021）

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的色素脫失性皮膚疾病，主要是黑素細(xì)胞減少或黑素細(xì)胞功能障礙，特征表現(xiàn)為皮膚及黏膜色素脫失。目前，全球患病率為0.50%～2.00%［1］，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制與免疫功能紊亂、氧化應(yīng)激損傷、黑色素細(xì)胞功能異常、線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷等因素相關(guān)［2］。白癜風(fēng)雖然不影響患者的身體健康和生命安全，但隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)自己的樣貌有了更高要求。白癜風(fēng)嚴(yán)重影響了患者的精神健康和生活質(zhì)量，長(zhǎng)期外表的明顯改變會(huì)使得患者產(chǎn)生嚴(yán)重的自卑心理［3］。進(jìn)而會(huì)影響患者的生活質(zhì)量［4］。烏杞益白膠囊具有滋補(bǔ)肝腎，疏肝調(diào)氣的功能，使得肝腎精血足而氣血和從而使脈絡(luò)充盈，肌膚得養(yǎng)、白斑得消。筆者觀察了烏杞益白膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)豚鼠模型的治療作用及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 烏杞益白膠囊（寧夏中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院制劑室提供）；丹芪和血片（合肥華潤(rùn)神鹿藥業(yè)有限公司，批號(hào)：B20020925）。灌胃前用研磨器皿將藥物研磨為細(xì)末，用純凈水配制。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 黑色或黑色花豚鼠60只，體重300～400g，雌雄兼用，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。鼠全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（陜）2017-001。

1.1.3 儀器 Finnpipette移液器（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），20～200μL；電熱恒溫培養(yǎng)箱（武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司）；Tianshi洗板機(jī)、988洗板機(jī)（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開(kāi)發(fā)中心）；Rayto酶標(biāo)儀，RT-6100，450nm波長(zhǎng)（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；微量高速離心機(jī)（型號(hào)：TG16W，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（型號(hào)：TGL16M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；恒溫?fù)u床（型號(hào)：HT-111B，上海赫田科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（型號(hào)：AE1204，上海良平科學(xué)儀器有限公司）、瑞士PRECISA電子分析天平（型號(hào)：XB220A）。

1.1.4 試劑 豚鼠酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）ELISA檢測(cè)試劑盒（江萊生物JL52162）、豚鼠α黑色素細(xì)胞刺激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）ELISA檢測(cè)試劑盒（江萊生物JL52163）、豚鼠單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）ELISA檢測(cè)試劑盒（江萊生物JL17251）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模、給藥 取體重300～400g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半。隨機(jī)分為空白組，模型組，丹芪和血片組，烏杞益白膠囊高、中、低劑量組，每組10只。選擇豚鼠背部黑色皮膚為造模部位，先用剪刀剪去造模部位的長(zhǎng)毛，再用電動(dòng)剃毛刀剃去短毛，留出面積約5cm×5cm造模區(qū)域，用脫毛膏脫去剃毛區(qū)殘余黑色短毛。在去毛區(qū)涂抹2.5%的氫醌溶液，劑量0.1g/kg，涂抹次數(shù)為早晚各一次，連續(xù)涂抹30d，建立白癜風(fēng)豚鼠模型?？瞻捉M每天以同樣的次數(shù)涂抹等量的蒸餾水。除空白組外所有豚鼠經(jīng)皮膚鏡檢查證實(shí)造模成功?？瞻捉M、模型組豚鼠每日給予等容積純凈水灌胃，每日灌胃3次。丹芪和血片組給予丹芪和血片2.33g/（kg.d），每天灌胃3次，每6小時(shí)1次。烏杞益白高劑量組、中劑量組、低劑量組分別按0.93g/（kg.d），0.46g/（kg.d），0.23g/（kg.d）的劑量灌胃，每日灌胃3次，每6小時(shí)1次。連續(xù)灌胃30d。給藥期間，各組豚鼠每2d用脫毛膏在受試區(qū)脫毛1次，實(shí)驗(yàn)期間密切觀察豚鼠皮膚顏色變化。

1.2.2 豚鼠血清TYR、α-MSH、MAO含量測(cè)定 各組豚鼠在首次給藥前經(jīng)豚鼠后肢靜脈采血，轉(zhuǎn)速3500r/min，時(shí)間15min離心后取血清，保存于-80℃冰箱中。從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔，空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。樣本孔中加待測(cè)樣本50μL；空白孔加樣本稀釋液50μL?？瞻卓?，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（Peroxidase，HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。測(cè)血清中酪氨酸酶（TYR）、α黑色素細(xì)胞刺激素（a-MSH）、單胺氧化酶（MAO）的含量；末次給藥結(jié)束后豚鼠心臟取血，同樣方法測(cè)血清中酪氨酸酶（TYR）、α黑色素細(xì)胞刺激素（a-MSH）、單胺氧化酶（MAO）的含量。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 療效 豚鼠受試區(qū)皮膚拍照記錄色素脫失情況，進(jìn)行療效評(píng)估。療效分為有效和無(wú)效。無(wú)效：受試區(qū)皮膚出現(xiàn)色島及色素斑＜5%或無(wú)變化；有效：受試區(qū)皮膚出現(xiàn)色島及色素斑≥5%。

1.3.2 豚鼠受試區(qū)皮膚黑素毛囊數(shù) 各組豚鼠在受試區(qū)中心部位取1cm×1cm皮膚1塊，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察、毛囊計(jì)數(shù)，計(jì)算單位面積中有黑色素的毛囊數(shù)及所占比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（x-±s）表示，多組比較用單因素ANOVA檢驗(yàn)，兩兩組間比較用事后多重比較LSD法，治療前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用（n，%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)（確切概率法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制作情況 空白對(duì)照組豚鼠涂抹蒸餾水30d后，未出現(xiàn)脫色。模型組，丹芪和血片組，烏杞益白膠囊高、中、低劑量治療組用藥部位在實(shí)驗(yàn)第10天開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)點(diǎn)滴狀皮膚脫色（皮膚鏡圖1A），第28天造模豚鼠的造模部位皮膚均出現(xiàn)不同程度的脫色（皮膚鏡圖1B）。

圖1 模型組脫色情況

2.2 療效觀察 烏杞益白膠囊高劑量組有效率為80%、中劑量組有效率為70%，低劑量組有效率為50%，丹芪和血片組有效率為50%，模型組有效率為0%，五組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=16.228，P＜0.05）。烏杞益白膠囊高劑量組與中劑量組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），烏杞益白膠囊高劑量組與低劑量組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），烏杞益白膠囊高劑量組與丹芪和血片組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)動(dòng)物模型的療效［n（%）］

2.3 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)動(dòng)物模型黑素的影響 烏杞益白膠囊組、丹芪和血片組表皮基底細(xì)胞與棘層黑素分布及有黑素毛囊數(shù)明顯增加，與模型對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)動(dòng)物模型黑素的影響（±s）

表2 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)動(dòng)物模型黑素的影響（±s）

注：與模型組比較*P＜0.05

組別 黑素分布 黑素毛囊數(shù)空白對(duì)照組 ++++ 31.70±1.56模型對(duì)照組 ± 4.70±0.95丹芪和血片組 ++ 14.80±1.14*烏杞益白膠囊0.93g/（kg·d） +++ 26.70±1.50*烏杞益白膠囊0.46g/（kg·d） +++ 14.70±0.95*烏杞益白膠囊0.23g/（kg·d） ++ 10.70±0.95*P＜0.05

2.4 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)豚鼠模型血清酪氨酸酶含量的影響 將治療前的血清酪氨酸酶含量與治療后的酪氨酸酶含量進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.05）。治療后六組血清酪氨酸酶含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜O.05），見(jiàn)表3。

表3 治療前后對(duì)酪氨酸酶的影響（±s）

表3 治療前后對(duì)酪氨酸酶的影響（±s）

組別 n 治療前（μmol/L）治療后（μmol/L） t P空白組 10 12.74±1.40 12.90±1.25 1.438 0.184模型組 10 7.79±1.15* 8.26±1.43 1.826 0.101烏杞益白膠囊0.93g/（kg·d） 10 7.30±0.89* 11.06±0.80# 14.577 ＜0.001烏杞益白膠囊0.46g/（kg·d） 10 7.76±0.38* 10.79±1.58# 6.357 ＜0.001烏杞益白膠囊0.23g/（kg·d） 10 6.88±1.36* 7.98±1.58 2.014 0.075丹芪和血片 10 8.65±1.09* 12.22±0.98# 13.081 ＜0.001 F 38.021 27.710 P＜0.001 ＜0.001

2.5 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)豚鼠模型血清α黑色素細(xì)胞刺激素含量的影響 將治療前的血清α黑色素細(xì)胞刺激素含量與治療后的血清α黑色素細(xì)胞刺激素含量進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見(jiàn)表4。六組α黑色素細(xì)胞刺激素含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 治療前后對(duì)血清α黑色素細(xì)胞刺激素的影響（±s）

表4 治療前后對(duì)血清α黑色素細(xì)胞刺激素的影響（±s）

注：*與空白組相比P＜0.05；#與模型組相比P＜0.05

組別 n 治療前（μmol/L） 治療后（μmol/L） t P空白組 10 1.55±0.27 1.64±0.23 2.115 0.032模型組 10 1.21±0.13* 1.26±0.14 4.741 0.064烏杞益白膠囊0.93g/（kg·d） 10 1.17±0.10* 1.57±0.15# 8.451 ＜0.001烏杞益白膠囊0.46g/（kg·d） 10 1.11±0.66* 1.48±0.17# 9.287 ＜0.001烏杞益白膠囊0.23g/（kg·d） 10 1.04±0.37* 1.23±0.13 5.489 ＜0.001丹芪和血片 10 1.23±0.17* 1.60±0.18 12.557 ＜0.001 F 15.062 9.997 P＜0.001 ＜0.001

2.6 烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)豚鼠模型血清單胺氧化酶含量的影響 將治療前的血清單胺氧化酶含量與治療后的血清單胺氧化酶含量進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。6組血清單胺氧化酶含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 治療前后對(duì)單胺氧化酶的影響（±s）

表5 治療前后對(duì)單胺氧化酶的影響（±s）

注：*與空白組相比P＜0.05；#與模型組相比P＜0.05

組別 n 治療前（ng/mL） 治療后（ng/mL） t P空白組 10 44.78±2.76 44.98±2.71 0.493 0.692模型組 10 72.96±6.06* 71.93±6.76 0.409 0.634烏杞益白膠囊0.93g/（kg·d） 10 71.03±4.51* 53.19±5.53# 10.461 ＜0.001烏杞益白膠囊0.46g/（kg·d） 10 69.33±6.13* 57.13±4.09# 5.051 0.001烏杞益白膠囊0.23g/（kg·d） 10 73.75±7.11* 66.33±6.54 2.127 0.062丹芪和血片 10 67.10±4.02* 58.78±6.27# 7.017 ＜0.001 F 42.215 29.803 P＜0.001 ＜0.001

2.7 HE染色結(jié)果 空白組皮膚可見(jiàn)大量黑素顆粒；模型對(duì)照組皮膚毛囊數(shù)量相對(duì)較少，毛干、毛根及毛球部可觀察到少量的黑素顆粒；丹芪和血片組皮膚只見(jiàn)少量的黑素顆粒；烏杞益白膠囊高劑量組皮膚毛囊數(shù)量較低劑量組較多，可觀察到毛根及毛球有較多的黑素顆粒；烏杞益白膠囊中劑量組皮膚在真皮層可觀察到少量黑素顆粒；烏杞益白膠囊低劑量組毛囊數(shù)較少，可觀察到少量的黑素顆粒；見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色結(jié)果（×200倍）

3 討論

白癜風(fēng)在中醫(yī)學(xué)中又稱為“白癜”“白駁風(fēng)”?！夺t(yī)林改錯(cuò)》認(rèn)為“白癜風(fēng)，血瘀皮內(nèi)”。皮膚為身體的藩籬，外邪首先侵犯皮膚，肺五色主白，合皮毛，肺衛(wèi)受侵，皮膚則表現(xiàn)為白斑相應(yīng)?，F(xiàn)代醫(yī)家提出肝腎不足、氣血失和，病久氣滯血瘀為白癜風(fēng)主要病機(jī)［5］。肝五色主青，腎五色主黑，久病傷精耗血，肝血腎精受損，可現(xiàn)膚色減退和脫失，而發(fā)生白斑。腎為先天之本，腎藏精，肝藏血，肝腎同源，精血同源。肝腎不足可致皮膚失于濡養(yǎng)，出現(xiàn)白斑。劉巧教授［6］提出因?yàn)殚L(zhǎng)期的工作導(dǎo)致肝腎陰虛，故成年人的白癜風(fēng)治療應(yīng)當(dāng)以滋補(bǔ)肝腎為法。朱仁康［7］教授提出“肝腎陰虧，肌表不榮，腠理失于濡養(yǎng)，進(jìn)而發(fā)為白斑”的觀點(diǎn)。烏杞益白膠囊有滋補(bǔ)肝腎、疏肝調(diào)氣、肝腎精血充足、氣血調(diào)和、脈絡(luò)充盈、肌膚得養(yǎng)、白斑得消等功能，具備這些功效是白癜風(fēng)治療的重點(diǎn)。高如宏從事白癜風(fēng)臨床治療多年，他提出從“皮毛生腎”論治白癜風(fēng)，皮毛與肺、腎關(guān)系尤為密切。誠(chéng)如 《素問(wèn)·五勝生成篇》 中所裁：“肺之合皮也，其榮毛也。”《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》載：“西方生燥，燥生金，金生辛，辛生肺，肺生皮毛，皮毛生腎?！庇纱丝梢?jiàn)，皮毛不僅與肺密切相關(guān)，而且與腎相關(guān)緊盛。明·馬蒔《黃帝內(nèi)經(jīng)素問(wèn)注證發(fā)微》載：“腎主水，金實(shí)生之，故皮毛生腎。”清·張隱庵謂：“皮毛生腎，肺氣主于皮毛，因金氣而生腎?！鼻濉じ呤孔谥^：“皮毛復(fù)而所生，故皮毛生腎?！薄饵S帝內(nèi)經(jīng)素問(wèn)譯釋》裁：“皮毛潤(rùn)澤則又能生養(yǎng)于腎?！逼っ珴?rùn)澤需要?dú)庋甜B(yǎng)，腎為先天之本，腎藏精生血，肺主宣發(fā)肅降，肺將脾運(yùn)輸?shù)臍庋⒉缄惣∧w，肌膚得以滋養(yǎng)，皮膚潤(rùn)澤又能養(yǎng)于腎。肝腎同源，腎精充足，才能補(bǔ)養(yǎng)肝血。烏杞益白膠囊發(fā)明者高如宏認(rèn)為白癜風(fēng)的病位在肺肝腎，病機(jī)為氣血失和，精血不足而致，烏杞益白膠囊由我院制劑室加工而成，通過(guò)多年的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)療效穩(wěn)定，主要用于白癜風(fēng)穩(wěn)定期辨證為肝腎不足的患者。

酪氨酸酶作為一種銅結(jié)合金屬酶，可以催化酪氨酸生成多巴胺和多巴醌，所以在黑素合成中有著關(guān)鍵作用［8］，使黑素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素，白癜風(fēng)基本的病理變化就是黑素細(xì)胞減少或消失［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示烏杞益白膠囊能明顯增強(qiáng)酪氨酸酶的活性，可使白癜風(fēng)模型豚鼠血清酪氨酸酶含量升高，這表明對(duì)于白癜風(fēng)的皮損，烏杞益白膠囊有一定治療作用。

血清α黑色素細(xì)胞刺激素也稱為促黑激素，主要是刺激黑色素分泌，促使黑色素細(xì)胞樹(shù)突形成和保護(hù)黑色素細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示烏杞益白膠囊能顯著增強(qiáng)血清α黑色素細(xì)胞刺激素的活性，可使白癜風(fēng)模型豚鼠血清α黑色素細(xì)胞刺激素升高，促進(jìn)皮膚黑色素的生成。

單胺氧化酶是一種含Cu2+的金屬酶［10］，白癜風(fēng)患者血清單胺氧化酶活性往往增強(qiáng)，進(jìn)一步對(duì)黑素細(xì)胞造成損傷，實(shí)驗(yàn)研究則表明烏杞益白膠囊能下調(diào)血清單胺氧化酶的含量，減少對(duì)黑素細(xì)胞的損傷。

本實(shí)驗(yàn)研究表明不同劑量的烏杞益白膠囊對(duì)白癜風(fēng)動(dòng)物模型有較好治療效果，使豚鼠血清酪氨酸酶、血清α黑色素細(xì)胞刺激素升高，單胺氧化酶降低，說(shuō)明烏杞白膠囊能明顯改善白癜風(fēng)豚鼠的病變，為其臨床廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。對(duì)烏杞益白膠囊治療白癜風(fēng)作用機(jī)制的研究仍需深入，目前還只是研究了烏杞益白膠囊在酪氨酸酶和黑素合成中發(fā)揮的作用，可進(jìn)一步研究烏杞益白膠囊對(duì)黑素細(xì)胞的其他促進(jìn)作用。