王洪濤,丁 晶,邵元虎,張衛(wèi)信,傅聲雷,*

1 黃河中下游數(shù)字地理技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；河南大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院,開封 475004 2 煙臺(tái)大學(xué)環(huán)境與材料工程學(xué)院,煙臺(tái) 264005

土壤動(dòng)物廣泛分布在世界各地,是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。它們參與了眾多土壤生態(tài)過程,如土壤有機(jī)質(zhì)分解及營養(yǎng)元素生物地球化學(xué)循環(huán)等,在土壤健康和生物多樣性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1—3]。其中蚯蚓是土壤中最大的無脊椎動(dòng)物,被稱為土壤的“生態(tài)系統(tǒng)工程師”和“基石物種”。蚯蚓不僅可以改善土壤結(jié)構(gòu)和肥力,還可以影響土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán),并促進(jìn)植物生長[4—5]。此外,越來越多的研究表明,大量微生物定植在蚯蚓腸道內(nèi),這些腸道菌群直接參與了碳氮元素代謝轉(zhuǎn)化,在促進(jìn)宿主健康方面也起著至關(guān)重要的作用[6—8]。然而,我們對(duì)土壤動(dòng)物腸道微生物菌群的研究才剛剛開始,對(duì)于蚯蚓腸道菌群的組成多樣性和生態(tài)功能的了解還很缺乏。

砷是環(huán)境中廣泛存在的天然有毒類金屬元素。由于礦山開采、金屬冶煉等工業(yè)活動(dòng),以及畜糞、含砷農(nóng)藥等農(nóng)業(yè)活動(dòng)將大量砷排放入土壤中,從而引起土壤砷污染問題。當(dāng)前土壤砷污染已引起全球公眾的廣泛關(guān)注[9]。土壤中的砷元素可對(duì)植物、動(dòng)物產(chǎn)生不利影響,還可通過食物鏈在人體富集,對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。同時(shí),砷在土壤環(huán)境中的行為歸宿和生物毒性均與其化學(xué)形態(tài)有密切關(guān)系[10]。而環(huán)境中微生物在和砷的長期共存過程中,進(jìn)化出多種砷代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制,能夠調(diào)節(jié)砷的形態(tài)和遷移轉(zhuǎn)化,在砷的地球化學(xué)循環(huán)中起到關(guān)鍵作用[11]。此外,進(jìn)入農(nóng)田土壤的污染物砷嚴(yán)重影響蚯蚓的生長和繁殖,砷對(duì)蚯蚓生態(tài)毒理危害的研究已引起了廣泛關(guān)注[12—13]。微生物介導(dǎo)的砷轉(zhuǎn)化影響著砷的生物毒性,對(duì)于砷的遷移轉(zhuǎn)化過程具有重要作用。然而蚯蚓腸道內(nèi)微生物介導(dǎo)下砷的生物轉(zhuǎn)化過程還不清楚。因此,研究蚯蚓腸道微生物群落介導(dǎo)下的砷生物轉(zhuǎn)化過程,對(duì)于了解蚯蚓腸道在砷的土壤地球化學(xué)循環(huán)中所起的作用具有重要意義。

蚯蚓種類豐富,目前發(fā)現(xiàn)已達(dá)6000多種。不同類型的蚯蚓擁有大量的生物多樣性,共同維持著土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[14]。根據(jù)蚯蚓的生活習(xí)性及生態(tài)功能間的差異,研究者將蚯蚓分為3種生態(tài)型種類,即表?xiàng)?內(nèi)棲類和深棲類[15]。不同種類的蚯蚓,它們的生理構(gòu)造和代謝能力存在差異,而且這些差異有助于在蚯蚓生態(tài)群落中建立各自獨(dú)特的細(xì)菌群落,維持著土壤動(dòng)物的生物多樣性。因此,我們推測(cè)不同蚯蚓腸道微生物也存在顯著差異,且對(duì)砷毒性的響應(yīng)機(jī)制也存在一定差異,腸道內(nèi)的砷形態(tài)和生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因也存在不同。Button等[16]發(fā)現(xiàn)砷污染土壤中,蚯蚓Lumbricusrubellus和Dendrodrillusrubidus組織和腸道內(nèi)砷形態(tài)主要有三價(jià)砷(As(III)),五價(jià)砷(As(V))以及有機(jī)砷等多種形態(tài)。Wang等[17]研究了高濃度砷污染對(duì)單一蚯蚓Metaphiresieboldin腸道微生物的影響。然而該研究僅局限于單一生物物種,且砷濃度設(shè)置較高,與土壤環(huán)境中普遍存在砷濃度不相符合。因此, 開展廣泛砷濃度條件下對(duì)不同蚯蚓腸道微生物影響的差異性研究, 對(duì)于完善砷在地下動(dòng)物的生物化學(xué)循環(huán)多樣性等方面的知識(shí)具有重要意義。因此,本研究設(shè)定了一個(gè)較低濃度砷的土壤環(huán)境,且選取土壤系統(tǒng)中常見的4種蚯蚓為目標(biāo)物種,測(cè)定蚯蚓組織內(nèi)砷的含量,腸道微生物與砷轉(zhuǎn)化基因,并分析它們之間的聯(lián)系。研究結(jié)果將有助于我們理解砷在地下土壤動(dòng)物腸道內(nèi)生物多樣性的轉(zhuǎn)化過程。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤采自浙江寧波某塊廢棄菜地,同時(shí)在該地附近農(nóng)田采集蚯蚓。采集完成后,將土壤和蚯蚓一并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。野外采集土壤風(fēng)干過篩后備用,蚯蚓則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴化及種類鑒定[17]。最后從中選取4種常見蚯蚓種類,分別是安德愛勝蚓(Eiseniaandrei),湖北遠(yuǎn)盲蚓(Amynthashupeiensis),加州腔蚓(Metaphirecalifornica)和通俗腔蚓(Metaphirevulgaris)。

稱取過10目篩的風(fēng)干土樣加到聚乙烯塑料保鮮盒中,充分混勻,用超純水配置As(V)母液(溶解固體含砷化合物Na3AsO4·12H2O),分別將對(duì)應(yīng)濃度As(V)溶液,均勻加入到保鮮盒中,溶液充分淹沒土壤并混勻,放在實(shí)驗(yàn)室老化半個(gè)月,從而得到一系列處理土壤樣品。本次實(shí)驗(yàn)共設(shè)四個(gè)處理,即空白(砷的背景濃度為5 mg/kg)無蚯蚓,空白(砷的背景濃度為5 mg/kg)有蚯蚓,砷濃度分別為15 mg/kg和25 mg/kg的蚯蚓處理組,每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù),其中空白無蚯蚓處理是為了探討蚯蚓活動(dòng)對(duì)土壤背景值下砷生物轉(zhuǎn)化行為的影響。同時(shí)每個(gè)保鮮盒容器內(nèi)放入10條大小和重量相似的同一種蚯蚓,即每個(gè)保險(xiǎn)盒內(nèi)一共40條蚯蚓。最后保鮮盒放入培養(yǎng)箱內(nèi)(光照/黑暗循環(huán)時(shí)間各一半,相對(duì)濕度75%,溫度20—22℃)培養(yǎng)28 d。實(shí)驗(yàn)期間,定期向土壤中加入無菌超純水,保證土壤含水率保持在30%左右。

1.2 樣品分析方法

1.2.1樣品DNA提取

每份土壤樣品充分混勻,裝入無菌自封袋中,多余土壤樣品風(fēng)干測(cè)理化性質(zhì)。用無菌鑷子將蚯蚓從土壤樣品取出,同時(shí)去除體表土壤殘余物,并在無菌超純水中漂洗五次,然后在無菌操作臺(tái)上使用無菌鑷子和無菌剪刀將蚯蚓解剖,取出其腸道內(nèi)含物。提DNA的土樣和蚯蚓腸道樣品,均放在-20 ℃冰箱備用。測(cè)砷形態(tài)的土壤、腸道和蚯蚓組織樣品,存于-80 ℃冰箱備用。本實(shí)驗(yàn)使用Fast DNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedical, 美國)規(guī)格提取試劑盒提取土樣和腸道樣品DNA。使用紫外分光光度計(jì) ND- 1000測(cè)定所提DNA濃度,最后將DNA樣品儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增,高通量測(cè)序和微生物群落生物分析

以提取DNA為模板,并對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的可變V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′),而下游引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′),其下游引物含有6 個(gè)堿基片段的barcode。PCR的擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；然后30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增,每個(gè)循環(huán)含95 ℃變性20 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化回收并混庫后,送測(cè)序公司(諾禾致源,中國)進(jìn)行Illumina測(cè)序。使用服務(wù)器QIIME 1對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行下游分析[18]。其中,原始序列需要進(jìn)行分類,然后去除低質(zhì)量或模糊序列,從而得到高品質(zhì)目標(biāo)序列。隨后用Uclust聚類法(97%的相似度水平)將高質(zhì)量序列進(jìn)一步聚類為操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)[19—20]。接著通過稀有化分析獲得樣品序列的多樣性,其中通過不同測(cè)序深度下細(xì)菌群落多樣性可得到每個(gè)樣品內(nèi)在多樣性(即Alpha多樣性,如Chao1指數(shù)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)等),通過計(jì)算相同測(cè)序深度來比較不同樣品間的多樣性(即Beta多樣性,如基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析)。

1.2.3高通量定量PCR

我們采用SmartChip Real-time PCR Systems(WaferGen,美國)高通量熒光定量系統(tǒng)對(duì)所有樣品中砷生物轉(zhuǎn)化基因進(jìn)行定量測(cè)序。引物一共有80對(duì),包含79對(duì)砷轉(zhuǎn)化基因和16S rRNA gene,引物具體信息以及定量PCR體系溫度時(shí)間條件設(shè)定參數(shù)參考Zhao等[21]的研究。根據(jù)砷轉(zhuǎn)化基因的功能特征,將其分為四類,即五價(jià)砷還原(As(V) reduction),三價(jià)砷氧化(As(III) oxidation),砷(去)甲基化(As (de)methylation),和砷轉(zhuǎn)運(yùn)(As transport)。一個(gè)基因檢測(cè)閾值(CT,31)被用來作為有效擴(kuò)增基因的主要依據(jù),同時(shí)每個(gè)樣品包含3 個(gè)技術(shù)重復(fù)(三次技術(shù)重復(fù)都擴(kuò)增出來時(shí),才認(rèn)定該樣品檢測(cè)出來)。此外,通過公式(1)計(jì)算每個(gè)樣品的基因拷貝數(shù), 當(dāng)CT值超出31或?yàn)?時(shí),認(rèn)定該基因沒有檢測(cè)出來,其對(duì)應(yīng)的CT值被替換為31。為降低樣品間DNA提取效率差異,使用公式(2)將公式(1)轉(zhuǎn)換為歸一化的基因豐度,即每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞基因的拷貝數(shù),在這里計(jì)為其相對(duì)豐度。

(1)

Relative abundance=4.1× (Relative ABG Copy Number/Relative 16S rRNA Copy Number)

(2)

1.2.4樣品理化分析

土壤pH值采用pH儀進(jìn)行測(cè)定(水土比為2.5∶1),土壤TC和TN使用C/N 分析儀(Vario MAX C/N,德國)燃燒法進(jìn)行測(cè)定,TOC分析儀(Vario TOC cube,德國)測(cè)定土壤總有機(jī)碳TOC。采用微波消解儀(CEM Microwave Technology Ltd., 英國) 進(jìn)行土壤重金屬預(yù)消解,具體消解體系及消解程序參照我們之前的方法[17]。土壤中As、Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn含量由電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS, Agilent 7500 ce, Agilent Technologies, 美國)測(cè)定。每批消解樣品都有3個(gè)空白對(duì)照,以及兩個(gè)樣品技術(shù)平行,樣品平行重復(fù)的相對(duì)偏差均在10%以內(nèi),其中使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)黃棕壤GBW07403和扇貝GBW07403來進(jìn)行校準(zhǔn)驗(yàn)證,回收率均在91.1%—109.3%之間,達(dá)到要求。此外,土壤,蚯蚓腸道及組織樣品砷形態(tài)的提取方法同樣參照之前方法,后續(xù)使用高效液相色譜(HPLC, Agilent 1200, Agilent Technologies, 美國)和ICP-MS聯(lián)用測(cè)定樣品的砷形態(tài)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中均值,百分比,變異系數(shù),標(biāo)準(zhǔn)差和熱圖等均采用Excel 2016(Microsoft,美國)完成。各個(gè)樣品間顯著性分析采用SPSS V18.0(IBM,美國),其中本文使用單因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)比較數(shù)據(jù)在0.05水平上的顯著性,顯著性檢驗(yàn)的方法用Tukey HSD進(jìn)行檢驗(yàn)包括數(shù)據(jù)前期正態(tài)分布檢驗(yàn)。微生物數(shù)據(jù)分析主要基于R(version 3.4.3)軟件繪制,如使用R vegan2.3- 1工具進(jìn)行了主坐標(biāo)分析,Adonis test算法檢驗(yàn)不同樣品間的微生物群落分布顯著性。柱狀圖和箱線圖等由Origin Pro8.5(OriginLab,美國)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蚯蚓間體重,存活率,砷總量和形態(tài)的響應(yīng)差異

經(jīng)28天污染土壤暴露后,3個(gè)處理組間所有蚯蚓的體重(濕重)和數(shù)目(存活率)均無顯著差異變化(ANOVA,P>0.05；表1),土壤中低濃度砷對(duì)蚯蚓存活數(shù)及生長影響不大。此外,這4種蚯蚓的體重之間存在較大差異,如通俗腔蚓的體重為4.67 g,是安德愛勝蚓體重的12.4倍(P<0.05)。

表1 蚯蚓體重和數(shù)量變化特征

數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=5)表示；相同字母(a)表示不同處理間的數(shù)據(jù)不存在顯著差異(在0.05水平上,ANOVA);As5：砷濃度為5 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 5 mg/kg；As15：砷濃度為15 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 15 mg/kg；As25：砷濃度為25 mg/kg的處理組 Treatment with arsenic concentration of 25 mg/kg;Ea：安德愛勝蚓Eiseniaandrei；Ah：湖北遠(yuǎn)盲蚓Amynthashupeiensis；Mc：加州腔蚓Metaphirecalifornica；Mv：通俗腔蚓Metaphirevulgaris

隨著土壤中砷濃度的增加,所有蚯蚓腸道和組織中砷含量均呈現(xiàn)一個(gè)增加的趨勢(shì)(P<0.05；圖1)。如As5處理中安德愛勝蚓組織砷濃度為11.8 mg/kg,但在As25處理中其砷濃度富集至38.1 mg/kg。加州腔蚓腸道在As25處理中砷含量(28.9 mg/kg)是其As5處理中(7.01 mg/kg)的4.1倍。同時(shí),不同蚯蚓在同一土壤處理組中的砷富集濃度存在較大差異。4種蚯蚓富集系數(shù)由高到低依次為：安德愛勝蚓(1.93)> 安德愛勝蚓(0.80)> 通俗腔蚓(0.78)> 湖北遠(yuǎn)盲蚓(0.52)。如處理As25中加州腔蚓組織砷含量為21.3 mg/kg,而相同處理下湖北遠(yuǎn)盲蚓砷濃度僅為10.8 mg/kg。從圖1中,我們可以看到土壤中砷形態(tài)主要以As(V)為主,As(III)僅占17.0%。而在各個(gè)蚯蚓腸道或組織內(nèi),砷形態(tài)均以As(III)為主,占總砷含量高達(dá)80.7%。同時(shí)在安德愛勝蚓腸道組織中,檢測(cè)到部分有機(jī)砷,主要以砷甜菜堿(Arsenobetaine, AsB)為主,占比11.7%。湖北遠(yuǎn)盲蚓僅組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了部分有機(jī)砷AsB。

圖1 蚯蚓組織和腸道內(nèi)砷富集濃度和砷形態(tài)所占百分比Fig.1 Arsenic concentrations and proportion of arsenic species in the soil, earthworm body tissues and gut圖中右側(cè)C：對(duì)照無蚯蚓組；As(V)：五價(jià)砷 Pentavalent arsenic；As(III)：三價(jià)砷 Trivalent arsenic；AsB：砷甜菜堿 Arsenobetaine;數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=5)表示;Ea：安德愛勝蚓 Eisenia andrei；Ah：湖北遠(yuǎn)盲蚓 Amynthas hupeiensis；Mc：加州腔蚓 Metaphire californica；Mv：通俗腔蚓 Metaphire vulgaris

2.2 土壤和各種蚯蚓腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

從基本理化性質(zhì)來看,土壤和蚯蚓腸道之間存在較大差異(表2)。蚯蚓腸道pH值為6.74,較高于周圍土壤的pH值(6.11)。蚯蚓腸道內(nèi)總碳(125 mg/g)和總可溶性碳(56.2 mg/g)含量顯著高于土壤中含量(分別為33.3 mg/g和0.48 mg/g,P<0.01)。此外,蚯蚓腸道內(nèi)重金屬鎘(Cd)含量(2.73 mg/kg)顯著高于土壤中鎘含量(0.2 mg/kg,P<0.01)。

表2 本研究中土壤和蚯蚓腸道原位性質(zhì)

所有樣品經(jīng)過微生物群落高通量測(cè)序和下游分析后,一共獲得高質(zhì)量9 903 591個(gè)高質(zhì)量序列,這些序列根據(jù)97%的相似性原則進(jìn)行OTUs聚類,共得到95 900個(gè)OTUs。其中土壤的OTUs數(shù)目(36 294)顯著高于蚯蚓腸道OTUs數(shù)目(P<0.01)。同時(shí),土壤和蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成成分間存在差異。變形菌門(Proteobacteria),厚壁菌門(Firmicutes),綠彎菌門(Chloroflexi),放線菌門(Actinobacteria),和酸桿菌門(Acidobacteria)是土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,它們?cè)诳偩褐姓紦?jù)的比例高達(dá)73.4%。而各個(gè)蚯蚓腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌基本一致,主要是放線菌,厚壁菌和變形菌等,它們的相對(duì)豐度總和比例為76.6%(圖2)。其中土壤酸桿菌門(9.3%)的豐度顯著高于各個(gè)蚯蚓腸道內(nèi)(0.7%)的豐度(P<0.01),而土壤放線菌門(11.0%)豐度顯著低于各個(gè)蚯蚓腸道內(nèi)(28.0%)的豐度(P<0.01)。

圖2 土壤和蚯蚓腸道細(xì)菌群落在門和屬水平上的物種組成和相對(duì)豐度Fig.2 Composition and abundance of bacterial community of soil and gut at the phylum and genus level圖中僅顯示了前11個(gè)高豐度的細(xì)菌組成,其他均歸為“Other”類別;圖例中文注釋,變形菌門：Proteobacteria；厚壁菌門：Firmicutes；綠彎菌門：Chloroflexi；放線菌門：Actinobacteria；酸桿菌門：Acidobacteria；擬桿菌門：Bacteroidetes；浮霉菌門：Planctomycetes；泉古菌門：Crenarchaeota；疣微菌門：Verrucomicrobia；芽單胞菌門：Gemmatimonadetes；軟壁菌門：Tenericutes。熱圖顯示了豐度最高的前24種屬水平上的物種組成。如屬水平上物種不確定,則使用該水平上一級(jí)(科或目水平)的物種組成,顏色越紅表示豐度越高,顏色越藍(lán)表示豐度越低。圖例中文注釋,魯梅爾芽胞桿菌屬：Rummeliibacillus；微單孢菌科：Micromonosporaceae；分支桿菌屬：Mycobacterium；類諾卡氏菌科：Nocardioidaceae；黃色土源菌：Flavisolibacter；凱氏桿菌屬：Kaistobacter；科里氏菌科：Koribacteraceae；黃單胞菌科：Xanthomonadaceae；紅游動(dòng)菌屬：Rhodoplanes；黃桿菌屬：Flavobacterium；紅螺菌科：Rhodospirillaceae；假單胞菌屬：Pseudomonas；伊索菌科：Isosphaeraceae；梭菌屬：Clostridium；紅桿菌目：Solirubrobacterales；芽孢桿菌屬：Bacillus；纖線桿菌科：Ktedonobacteraceae；鏈霉菌屬：Streptomyces；氣單胞菌科：Aeromonadaceae

熱圖(圖2)顯示了土壤和各個(gè)蚯蚓腸道間在屬水平上細(xì)菌群落組成差異。土壤各組成成分豐度變化不大,豐度最高細(xì)菌Ktedonobacteraceae所占序列也僅為5.0%,而腸道內(nèi)微生物群落組成則較集中,如加州腔蚓和通俗腔蚓腸道內(nèi)Aeromonadaceae豐度分別高達(dá)16.9%和19.5%。此外,土壤中CandidatusKoribacter的豐度為2.4%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在蚯蚓腸道內(nèi)的豐度(0.1%,P<0.05)。

除了微生物組成成分存在差異以外,土壤和各個(gè)蚯蚓腸道細(xì)菌群落分布模式也存在顯著差異。圖3中主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示,土壤菌群模式聚集在一起,分布在坐標(biāo)軸右側(cè),沿著第一軸與分布在左側(cè)的各個(gè)蚯蚓腸道細(xì)菌群落模式顯著隔開(Adonis test, R=0.94,P<0.005)。同時(shí)安德愛勝蚓和湖北遠(yuǎn)盲蚓腸道細(xì)菌群落聚集在左側(cè)下方,而加州腔蚓和通俗腔蚓聚集在左側(cè)上方,這兩類腸道菌群主要沿第二軸顯著分開(Adonis test,P=0.001)。此外,土壤細(xì)菌多樣性顯著高于各個(gè)蚯蚓腸道內(nèi)多樣性(P<0.01,圖3)。其中Shannon指數(shù)表明加州腔蚓腸道細(xì)菌多樣性顯著低于安德愛勝蚓和湖北遠(yuǎn)盲蚓。

圖3 土壤和蚯蚓腸道細(xì)菌群落beta多樣性和alpha多樣性Fig.3 Beta diversity and alpha diversity of bacterial communities in soil and earthworm gut圖中土壤和蚯蚓腸道細(xì)菌群落beta多樣性分布圖是基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析繪制的;箱線圖顯示土壤和腸道細(xì)菌群落Shannon指數(shù)的差異。不同字母(abc)顯示土壤和各個(gè)蚯蚓間的細(xì)菌多樣性在0.05水平上存在顯著差異(ANOVA)

2.3 各種蚯蚓腸道微生物對(duì)砷污染的不同響應(yīng)

土壤中低濃度砷改變4種蚯蚓腸道內(nèi)群落組成,且各種蚯蚓腸道微生物對(duì)砷響應(yīng)存在較大差異。如對(duì)照組中安德愛勝蚓腸道變形菌門豐度為22.7%,而As25處理中其腸道內(nèi)變形菌門的豐度下降到13.7%(P<0.05)。圖4展示了4種蚯蚓腸道內(nèi)科水平細(xì)菌群落主要組成成分的變化。所有蚯蚓腸道內(nèi)假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的豐度隨著土壤砷濃度的增加而顯著減少(P<0.05),芽胞桿菌科(Bacillaceae),動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)在湖北遠(yuǎn)盲蚓,安德愛勝蚓和加州腔蚓腸道內(nèi)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),即顯著增加(P<0.05)。相對(duì)于其他3種蚯蚓,通俗腔蚓內(nèi)細(xì)菌群落變化較少。此外,低濃度砷暴露還能改變腸道細(xì)菌群落多樣性。如As25處理組湖北遠(yuǎn)盲蚓腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照處理組,而As25處理組通俗腔蚓腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性Chao1指數(shù)顯著低于對(duì)照處理組(P<0.05)。通過Adonis test統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)低濃度砷顯著改變4種蚯蚓腸道微生物結(jié)構(gòu)模式(P<0.05,圖3)。

圖4 各個(gè)蚯蚓腸道內(nèi)砷處理下科水平細(xì)菌的差異性變化Fig.4 Different changes of bacterial families among arsenic treatments in different earthworm gutBacillaceae：芽胞桿菌科；Streptomycetaceae：鏈霉菌科；Planococcaceae：動(dòng)性球菌科；Pseudomonadaceae：假單胞菌科；圖中不同字母表示腸道細(xì)菌群落多樣性在3個(gè)處理間存在顯著差異(在0.05水平上,ANOVA)

2.4 砷生物轉(zhuǎn)化基因多樣性與豐度分布特征

土壤和蚯蚓腸道樣品內(nèi)一共檢測(cè)到17種砷的生物轉(zhuǎn)化基因(圖5),并且土壤中的砷轉(zhuǎn)化基因數(shù)目顯著高于腸道內(nèi)基因數(shù)目(P<0.05)。其中土壤中檢測(cè)到的砷轉(zhuǎn)化基因數(shù)目最多為17個(gè),在湖北遠(yuǎn)盲蚓腸道內(nèi)檢測(cè)到的基因數(shù)目最少為7個(gè)。外源砷的添加沒有顯著改變土壤或腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因的數(shù)量(P>0.05)。此外樣品中砷轉(zhuǎn)化基因相對(duì)豐度的檢測(cè)范圍為0.56—0.63 拷貝數(shù)/每細(xì)胞,外源砷的添加也沒有明顯改變土壤中砷轉(zhuǎn)化基因的豐度,但蚯蚓腸道內(nèi)基因的豐度變化范圍較大,最低為0.05 拷貝數(shù)/每細(xì)胞(As25處理-湖北遠(yuǎn)盲蚓腸道內(nèi)),最高豐度則達(dá)到0.47 拷貝數(shù)/每細(xì)胞(As15處理-通俗腔蚓腸道內(nèi))。土壤中砷轉(zhuǎn)化基因的豐度顯著高于各個(gè)蚯蚓腸道(P<0.05,圖5)。4種蚯蚓腸道內(nèi)砷基因隨著外源砷的增加,其豐度均呈現(xiàn)一個(gè)先增加后減少的趨勢(shì)。如空白處理下湖北遠(yuǎn)盲蚓腸道內(nèi)砷豐度為0.11 拷貝數(shù)/每細(xì)胞,As15處理下其豐度增加到0.13 拷貝數(shù)/每細(xì)胞,最后在As25處理中豐度顯著下降到0.05 拷貝數(shù)/每細(xì)胞(P<0.05)。根據(jù)砷生物轉(zhuǎn)化基因的功能分類,土壤中砷轉(zhuǎn)化基因主要以As(III)氧化和As(V)還原為主,而在腸道內(nèi)主要以As(V)還原和砷轉(zhuǎn)運(yùn)基因?yàn)橹?圖5)。

圖5 土壤和蚯蚓腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因的檢測(cè)數(shù)目和相對(duì)豐度Fig.5 The detected number and relative abundance of arsenic biotransformation genes (ABGs) in microbiome of soil and earthworm gutAs (III) oxidation：三價(jià)砷氧化基因；As (V) reduction：五價(jià)砷還原基因；As (de)methylation：砷(去)甲基化基因；As Transport：砷轉(zhuǎn)運(yùn)基因;圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)低濃度砷對(duì)蚯蚓體重和生長變化無顯著影響,但能顯著改變蚯蚓腸道微生物群落。土壤砷濃度最高僅為25 mg/kg,明顯低于很多研究報(bào)道的蚯蚓半致死濃度[22—23]。同時(shí)rut等[24]發(fā)現(xiàn)微生物對(duì)污染物響應(yīng)較敏感,蚯蚓腸道微生物可用來作為重金屬污染的生物指示物。因此我們可以推測(cè)蚯蚓腸道微生物群落的擾動(dòng)可作為對(duì)土壤污染物前期監(jiān)測(cè)的重要生物指標(biāo)。同時(shí)4種蚯蚓組織內(nèi)砷濃度會(huì)隨著土壤中砷濃度的增加而增加,即砷污染會(huì)引起蚯蚓體內(nèi)砷的生物富集。這是容易理解的,蚯蚓長期生活在土壤圈內(nèi),砷元素可通過皮膚接觸或蚯蚓攝食行為,進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)從而不斷富集[25]。但不同種類蚯蚓的富集系數(shù)存在較大差異,這與各種蚯蚓的生態(tài)習(xí)性有很大聯(lián)系[26]。其中安德愛勝蚓屬表?xiàng)?主要以枯枝碎屑為食。而其它種蚯蚓屬內(nèi)棲類,主要以礦質(zhì)土壤為食。食物來源不同,其進(jìn)入各種蚯蚓體內(nèi)的砷含量自然存在較大差異。此外,這也和蚯蚓自身生理結(jié)構(gòu)和腸道微生物也有一點(diǎn)關(guān)系[8]。如加州腔蚓和通俗腔蚓屬同種生態(tài)型和同種分屬,且它們個(gè)體大小,腸道構(gòu)造和腸道微生物群落組成最為相似,因此這兩種蚯蚓砷富集系數(shù)也基本相同。

本研究表明土壤中砷形態(tài)以As(V)為主,而蚯蚓腸道主要以As(III)為主。土壤為好氧條件,其氧化還原電位為正。而蚯蚓腸道是一個(gè)厭氧環(huán)境,包括厭氧菌在內(nèi)的大量微生物參與了砷的生物化學(xué)形態(tài)轉(zhuǎn)化,As(V)將被還原為As(III),當(dāng)然腸道內(nèi)高有機(jī)質(zhì)和中性pH等獨(dú)特微環(huán)境可能也是引起砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的重要因素[6—7,17]。此外,各種蚯蚓腸道內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因以As(V)還原基因?yàn)橹?這與腸道內(nèi)砷形態(tài)結(jié)果相一致。As(V)被還原為As(III)是微生物代謝最為關(guān)鍵的一個(gè)過程,As(III)將進(jìn)行甲基化反應(yīng)生成甲基砷等低毒有機(jī)砷,這些毒性較小的砷形態(tài)經(jīng)砷轉(zhuǎn)運(yùn)基因外排出體外,從而達(dá)到解毒目的[16—17,27]。我們?cè)隍球灸c道微生物內(nèi)均檢測(cè)到砷甲基化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶AsM和部分有機(jī)砷 AsB,這和大部分研究結(jié)果一致[16,27],也驗(yàn)證了關(guān)于蚯蚓腸道內(nèi)微生物參與下砷形態(tài)轉(zhuǎn)化的猜想。同時(shí),4種蚯蚓體內(nèi)砷轉(zhuǎn)化基因豐度會(huì)隨著土壤中砷濃度增加,呈現(xiàn)出一個(gè)先增加后減少的趨勢(shì)。研究表明土壤中金屬濃度較低時(shí)能刺激微生物的生長,增加微生物活性。但當(dāng)金屬濃度升高時(shí),會(huì)出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng),使微生物生物量出現(xiàn)一個(gè)減少趨勢(shì)[28]。據(jù)此推測(cè),低濃度砷可以刺激并提高腸道內(nèi)微生物的活性,而較高濃度砷則抑制其腸道內(nèi)微生物的活性,從而影響腸道內(nèi)生物代謝速率,進(jìn)而間接影響到微生物介導(dǎo)下的砷生物轉(zhuǎn)化基因的豐度。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示4種蚯蚓腸道微生物均與土壤微生物群落存在顯著差異,這與土壤和腸道所處微環(huán)境有直接關(guān)系[7,17,29—30]。從表2看出蚯蚓腸道缺氧,pH偏中性,可溶性碳氮含量遠(yuǎn)高于好氧的土壤。同時(shí)各種蚯蚓腸道微生物群落間也存在很大差異?？赡茉蛑饕袃蓚€(gè),第一不同生態(tài)型的蚯蚓自身生理構(gòu)造存在差異,特別是腸道內(nèi)的結(jié)構(gòu)存在不同。當(dāng)然各個(gè)蚯蚓攝食習(xí)慣的不同也會(huì)引起腸道菌群的差異。Knapp等[31]發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道微生物組對(duì)所攝取的食物來源有很強(qiáng)的依賴性。加州腔蚓和通俗腔蚓腸道內(nèi)氣單胞菌科(Aeromonadaceae)的相對(duì)豐度高達(dá)16%,而在安德愛勝蚓腸道內(nèi)僅為0.3%。該菌在水體和淤泥中被大量發(fā)現(xiàn),是動(dòng)物體內(nèi)常見的致病菌[32—33]。加州腔蚓和通俗腔蚓可能吞食大量含砷土壤,且長期生活在土壤內(nèi)部,可能會(huì)接觸較多的致病菌,從而引發(fā)蚯蚓腸道微生物出現(xiàn)紊亂。而安德愛勝蚓主要生活在土壤表層,主要以富含有機(jī)質(zhì)枯枝落葉為食。第二,進(jìn)入蚯蚓腸道內(nèi)的砷以毒性更高的As(III)存在,同時(shí)蚯蚓腸道細(xì)菌群落較土壤菌群敏感,因此進(jìn)入蚯蚓組織腸道內(nèi)砷對(duì)腸道菌群產(chǎn)生不同差異毒害。如假單胞菌科(Pseudomonadaceae)內(nèi)很多細(xì)菌具有分解營養(yǎng)元素的能力[34]。和空白處理組相比,As25處理中4種蚯蚓腸道內(nèi)假單胞菌科的豐度均顯著降低,這表明污染物砷的添加能夠破壞蚯蚓腸道微生物分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力,從而抑制蚯蚓正常代謝。

4 結(jié)論

土壤中廣泛存在的砷元素對(duì)蚯蚓生態(tài)毒理無顯著影響,但顯著改變其腸道微生物群落結(jié)構(gòu),這表明蚯蚓腸道微生物組的變化可能比蚯蚓毒理指標(biāo)更適合做土壤污染的指示性指標(biāo)。同時(shí)蚯蚓腸道菌群和土壤群落顯著不同,且蚯蚓腸道細(xì)菌多樣性顯著低于土壤。蚯蚓組織和腸道內(nèi)砷形態(tài)主要以As(III)為主,其次是少量As(V)和有機(jī)砷,這和腸道內(nèi)As(V)還原和轉(zhuǎn)運(yùn)為主的砷轉(zhuǎn)化基因分布特征一致,顯示蚯蚓腸道是一個(gè)微生物介導(dǎo)下砷形態(tài)轉(zhuǎn)化多樣性的潛在熱區(qū)。然而本文關(guān)于蚯蚓腸道內(nèi)砷還原和轉(zhuǎn)運(yùn)解毒的機(jī)制和原理尚不清楚,有待深入發(fā)掘。