陳芊如， 丁蓬勃， 胡希好， 趙福彬， 邰振益， 趙忠利， 劉宗霞， 李義強(qiáng)， 鄒 平

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266000； 2.山東青島煙草有限公司，山東青島 266000)

煙草是一種喜溫植物，其最適生長(zhǎng)溫度范圍是25～28 ℃，當(dāng)溫度下降至12 ℃以下時(shí)，煙草出苗率下降，苗期生長(zhǎng)緩慢。低溫脅迫下，煙草幼苗體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，生理代謝發(fā)生紊亂，葉片光合速率下降，能量產(chǎn)生和物質(zhì)代謝受阻，最終導(dǎo)致植株葉片萎蔫甚至死亡。在福建省、江西省等南方煙區(qū)，在早春常有倒春寒等低溫危害發(fā)生；在西南、黃淮、東北煙區(qū)，苗床期低溫寡照的情況也時(shí)常發(fā)生，導(dǎo)致移栽后煙苗質(zhì)量差，還苗期延長(zhǎng)，煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量受到影響。因此，如何緩解低溫脅迫對(duì)煙草植株尤其是煙草幼苗的傷害是煙草生產(chǎn)中亟待解決的問題。

幾丁質(zhì)(別稱甲殼素)是一種天然聚合物，在地球上含量非常豐富，幾丁質(zhì)脫乙酰基后降解產(chǎn)生殼寡糖(COS)。殼寡糖是一種水溶性的堿性寡糖，也是一種海洋來源生物刺激素，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗病性和抗逆性。研究表明，殼寡糖能夠通過增強(qiáng)植株光合作用及抗氧化酶活性提高油菜、甘蔗、玉米、花生等作物的抗旱性。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖能夠通過調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運(yùn)及滲透調(diào)節(jié)提高小麥幼苗的抗鹽性；還能夠增強(qiáng)小麥光合作用及抗氧化能力，從而提高小麥低溫抗性。在煙草上，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，殼寡糖能夠誘導(dǎo)煙草對(duì)煙草花葉病毒(TMV)的侵染產(chǎn)生系統(tǒng)抗性；對(duì)煙草赤星病病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢量均有一定的抑制作用；但對(duì)殼寡糖能否提高煙草抗低溫脅迫的研究還未見報(bào)道。針對(duì)煙草幼苗易受冷害影響的生產(chǎn)實(shí)際問題，本試驗(yàn)選用低溫敏感的煙草品種為材料，研究低溫脅迫下殼寡糖對(duì)煙草幼苗生理指標(biāo)的影響，以期為煙草苗期栽培管理提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草資源為H382，屬于低溫敏感材料，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供。殼寡糖(脫乙酰度>95%，聚合度3～10)購(gòu)自肇慶市生物科技有限公司。試驗(yàn)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所人工氣候箱中進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2020年10—12月。

1.2 試驗(yàn)方法與測(cè)定指標(biāo)

1.2.1 培養(yǎng)方法 用1%次氯酸鈉溶液將H382種子消毒10 min，再用蒸餾水反復(fù)沖洗后晾干，點(diǎn)種至育苗盤。待煙草幼苗長(zhǎng)到4葉期時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗移栽到直徑為10 cm的塑料盆中，放入光照時(shí)間為14 h、晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃、光照度為 800 μm/(m·s)、相對(duì)濕度為(65±5)%的人工氣候培養(yǎng)箱中。

待煙草幼苗長(zhǎng)出第6張葉片時(shí)，將其隨機(jī)分為3組(每組20盆)。對(duì)照組(CK)于人工氣候培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)；低溫脅迫組于人工氣候培養(yǎng)箱4 ℃培養(yǎng)，并分別噴施0(Chilling stress)、50(T1)、100(T2)、500 mg/L(T3)殼寡糖，24 h后移到4 ℃人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在低溫脅迫后24、48、72 h取葉片，迅速放入液氮中速凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用以測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，每個(gè)處理3次重復(fù)。在低溫脅迫7 d后，進(jìn)行樣品采集測(cè)定其生物量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS(version 19.0)軟件中的Duncan’s多重比較分析法，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗活性氧(ROS)含量的影響

2.2 殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗MDA和脯氨酸含量的影響

從圖2可以看出，低溫脅迫下，煙草幼苗體內(nèi)MDA含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在脅迫24、48、72 h時(shí)，MDA含量分別比對(duì)照組高47.3%、62.9%、67.4%。殼寡糖處理能夠顯著降低煙草葉片中MDA含量，其中，100 mg/L殼寡糖效果最好，其處理組MDA含量顯著降低，與對(duì)照組沒有顯著性差異。在處理24、48、72 h時(shí)，T2處理組MDA含量分別比低溫脅迫組低26.6%、34.4%、37.6%(圖2-A)。隨著低溫處理時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，煙草幼苗中脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在脅迫24、48 h 時(shí)，脯氨酸含量分別是對(duì)照組的1.37、1.85倍；脅迫72 h時(shí)脯氨酸含量有所下降，但仍然是對(duì)照組的1.48倍。在低溫脅迫下，施用不同濃度殼寡糖能夠顯著增加煙草葉片脯氨酸含量。其中，100 mg/L 殼寡糖處理組脯氨酸含量顯著高于其他濃度處理組，在處理24、48、72 h時(shí)，脯氨酸含量分別比低溫脅迫組高37.2%、19.6%、40.1%(圖2-B)。

2.3 殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

從圖3可以看出，低溫脅迫24、48、72 h后，煙草幼苗葉片可溶性糖含量先升高后降低。在24、48 h 時(shí)，煙草葉片可溶性糖含量比對(duì)照組分別升高12.9%、12.7%；脅迫72 h后，煙草葉片可溶性糖含量比對(duì)照組略低，但與對(duì)照組之間無顯著性差異。不同濃度殼寡糖處理后，煙草葉片可溶性糖含量顯著升高；其中100 mg/L殼寡糖處理組在24、48、72 h時(shí)，可溶性糖含量比低溫脅迫組分別高19.9%、28.1%、64.6%(圖3-A)。在低溫脅迫下，煙草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；施用外源殼寡糖可以顯著提高煙草葉片可溶性蛋白含量(圖3-B)。

2.4 殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草葉片抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下，煙草幼苗葉片中的SOD、POD、CAT及APX活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在低溫脅迫24、48 h時(shí)，SOD活性分別比對(duì)照組高30.3%、26.1%(圖4-A)；POD活性分別比對(duì)照組高12.6%、26.3%(圖4-B)；CAT活性分別比對(duì)照組高45.0%、53.1%(圖5-A)；APX活性分別比對(duì)照組高24.5%、33.1%(圖5-B)。在低溫脅迫 72 h 后，SOD、POD、CAT及APX活性均有所下降。不同濃度殼寡糖處理能夠繼續(xù)提升SOD、POD、CAT及APX活性。在100 mg/L殼寡糖處理的24、48、72 h 時(shí)，SOD活性分別比低溫脅迫組高48.0%、70.4%、124.3%(圖4-A)；POD活性分別比低溫脅迫組高36.0%、47.0%、92.2%(圖4-B)；APX活性分別比低溫脅迫組高13.9%、35.1%、51.6%(圖5-A)；APX活性分別比低溫脅迫組高59.6%、69.0%、79.6%(圖5-B)?？梢姡┯猛庠礆す烟强梢燥@著提高煙草幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性，其中，100 mg/L殼寡糖處理組中煙草幼苗抗氧化酶活性最高。

2.5 殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗生物量的影響

對(duì)煙草幼苗繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)及低溫脅迫，在培養(yǎng)7 d時(shí)，處理組間煙苗表型差異明顯，低溫脅迫下，煙草幼苗長(zhǎng)勢(shì)緩慢，植株矮小，葉片出現(xiàn)萎蔫。與對(duì)照組相比，煙草幼苗根長(zhǎng)減少41.0%，地上部分和根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別減少22.5%、24.9%和45.4%、49.1%(表1)。噴施不同濃度殼寡糖溶液能夠緩解低溫脅迫對(duì)煙草幼苗的傷害，促進(jìn)植株與根系生長(zhǎng)。從表1可以看出，殼寡糖處理能夠顯著增加根長(zhǎng)，顯著提高煙草幼苗地上部分以及根系的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量。其中，100 mg/L殼寡糖處理后，煙草幼苗根系的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與其他濃度殼寡糖處理組差異顯著。

表1 低溫脅迫下殼寡糖對(duì)煙草幼苗生物量的影響

3 討論與結(jié)論

植物在逆境脅迫下細(xì)胞滲透勢(shì)會(huì)發(fā)生改變。植物通過積累可溶性糖和可溶性蛋白等小分子物質(zhì)，來降低細(xì)胞的水勢(shì)，維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡和膜的穩(wěn)定性，從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)；同時(shí)，糖類是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，而且是能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。周培祿通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下煙草氮代謝和糖代謝增強(qiáng)，提高了細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸和其他含氮物質(zhì)甜菜堿的含量，增加了可溶性糖含量，從而調(diào)節(jié)了細(xì)胞滲透式，維持細(xì)胞水分平衡，提高了煙草抗寒性。本試驗(yàn)中低溫脅迫24、48 h時(shí)，煙草幼苗體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均明顯增加；而在脅迫72 h時(shí)，含量則開始下降，這可能是因?yàn)榈蜏匾种屏酥参矬w內(nèi)酶活，造成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成和代謝受阻。外源施用殼寡糖可以進(jìn)一步顯著提高煙草幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，有助于維持植物的滲透平衡和細(xì)胞膜穩(wěn)定性。有研究表明，低溫脅迫下，噴施殼寡糖可以增加小麥體內(nèi)可溶性糖含量，減弱低溫對(duì)植物組織液的冷滯效應(yīng)，保證細(xì)胞中溶質(zhì)的流動(dòng)性。

在逆境脅迫下，脯氨酸發(fā)揮著多種生理學(xué)功能，游離脯氨酸具有強(qiáng)親水性，能夠降低細(xì)胞水勢(shì)，緩解逆境脅迫造成的細(xì)胞脫水；脯氨酸還能夠與蛋白質(zhì)形成輸水的骨架，保護(hù)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，維護(hù)植物體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整。有研究表明，外源施用脯氨酸能夠提高植物抗氧化酶活性，增強(qiáng)植株光合作用從而提高植物抗鹽性。有趣的是，脯氨酸處理組植株中內(nèi)源脯氨酸含量升高，可溶性糖含量降低，說明脯氨酸可能限制了鹽脅迫植物對(duì)可溶性糖合成的需要，而由脯氨酸起重要的滲透保護(hù)作用。本試驗(yàn)中低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的脯氨酸含量高于對(duì)照組，殼寡糖處理進(jìn)一步提高了低溫脅迫下煙草幼苗的脯氨酸含量，以緩解低溫導(dǎo)致的滲透脅迫。外源施用褐藻寡糖、水楊酸、調(diào)環(huán)酸鈣均可以提高低溫脅迫下煙苗幼苗體內(nèi)的脯氨酸含量，緩解低溫造成的滲透脅迫，提高植物抵抗低溫脅迫的能力。

綜上所述，施用外源殼寡糖可以降低低溫脅迫對(duì)煙草幼苗的氧化損傷，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強(qiáng)植株抗氧化活性，從而緩解煙草幼苗在低溫環(huán)境下受到的傷害。低溫脅迫下，殼寡糖對(duì)煙草幼苗的保護(hù)作用，為緩解煙草應(yīng)對(duì)倒春寒等低溫災(zāi)害提供了良好的思路。其中，100 mg/L殼寡糖對(duì)低溫脅迫下煙草幼苗的緩解作用最強(qiáng)，高濃度殼寡糖緩解效果反而降低；因此，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，考慮到效益及成本，100 mg/L殼寡糖是最優(yōu)選擇。為了更好地研究殼寡糖對(duì)煙草抗低溫能力的影響，其低溫緩解效應(yīng)的分子機(jī)制、品種的響應(yīng)差異還有待進(jìn)一步研究闡明。