馮金林， 姚麗霞， 秦銘徽

(山西師范大學生命科學學院/植物分子與環(huán)境脅迫響應山西省高等學校重點實驗室，山西臨汾 041004)

在真核生物中，蛋白質N末端乙?；揎?N-terminal acetylation，NTA)是一種非常普遍的共價修飾。蛋白質NTA是由一系列的N末端乙酰轉移酶(N-terminal acetyltransferase，Nat)催化完成的，Nat以乙酰輔酶A作為乙?；鶊F的供體，對蛋白質N末端的α氨基進行乙?；揎?，這種修飾主要是共翻譯修飾。不同的蛋白質NTA的生物學意義是不同的，包括調節(jié)蛋白的穩(wěn)定性、介導蛋白和蛋白之間的相互作用、影響蛋白的亞細胞定位等。擬南芥中有7種Nat，依次命名為Naa10～Naa70。已有研究表明，Naa10在植物胚胎發(fā)育過程中起了不可缺少的作用，Naa10缺失突變體表現(xiàn)出胚胎致死的表型。Naa20缺失突變體表現(xiàn)出植物生長的抑制，并且對鹽脅迫和滲透脅迫敏感。Naa30缺失突變體表現(xiàn)出光合效率的降低。Naa40在植物中的作用尚未報道。Naa50缺失突變體表現(xiàn)出根發(fā)育的缺陷和對ABA脅迫的敏感。Naa60蛋白定位于細胞膜，在植物對鹽脅迫的響應中發(fā)揮重要作用。Naa70是植物特異的葉綠體定位的N末端乙酰轉移酶。

高等植物的胚后發(fā)育主要包括營養(yǎng)生長和生殖生長2個階段。在營養(yǎng)生長階段，植物會經(jīng)歷幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變，只有成年態(tài)的植物在合適的外界環(huán)境刺激下才會被誘導開花，進而進入生殖生長階段。植物幼年態(tài)向成年態(tài)以及成年態(tài)向開花的生理轉變受到嚴格且復雜的調控，它能夠保證植物的繁殖以及后代的延續(xù)。在植物幼年態(tài)向成年態(tài)轉變的過程中，microRNA156和它的靶基因發(fā)揮了重要的作用。在幼年態(tài)的葉片中，葉片背面沒有表皮毛，microRNA156基因高水平表達，其靶基因的表達量較低；隨著發(fā)育進程的推進，microRNA156基因的表達量逐漸降低，其靶基因的表達量逐漸升高，促進植物由幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變，成年態(tài)的葉片背面開始出現(xiàn)表皮毛。擬南芥中HST(HASTY)是人輸出蛋白5(Exportin-5)的同源蛋白，參與植物microRNA156從細胞核轉運到細胞質，其突變體()植株表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉變的提前，并且開花時間也提前。

本研究通過對N末端乙酰轉移酶基因缺失突變體的表型進行觀察，并通過轉基因互補實驗、遺傳學分析和酵母雙雜交試驗，表明Naa20與Naa25具有直接的相互作用，通過調控HST進而抑制植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變以及調控開花時間，在植物營養(yǎng)生長時期轉變和生殖生長轉變過程中發(fā)揮了重要的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試劑

擬南芥野生型種子和突變體(CS814943)、(GK-134G09)和(CS24279)的種子背景為哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)，購自Arabidopsis Biological Resource Center。轉基因互補所用的包含GFP標簽的pCAMBIA1300載體為實驗室前期保存。

植物培養(yǎng)基所用MS鹽、Phytagel，均購自Sigma公司；RNA提取試劑、載體構建用限制性內切酶和T連接酶，均購自全式金公司；RNase-free DNase，購自Promega公司；反轉錄試劑盒，購自Invitrogen公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 突變體轉錄本水平的鑒定 將野生型和突變體的種子用75%乙醇消毒2 min，用滅菌水洗3次，4 ℃處理3 d，然后點種子到MS培養(yǎng)基上，在長日照培養(yǎng)箱(22 ℃，16 h光照；18 ℃，8 h黑暗)培養(yǎng)8 d。取野生型和突變體的幼苗100 mg，提取RNA并進行反轉錄，以獲得的cDNA作為模板，以基因特異的引物進行PCR擴增，以Actin作為內參基因。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.2 突變體表型分析 將消毒后的擬南芥種子4 ℃處理3 d后，點種子到MS培養(yǎng)基上，在長日照培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d，然后將擬南芥幼苗移栽到土里(蛭石和營養(yǎng)土按照體積比1 ∶1混勻)，在長日照植物培養(yǎng)間繼續(xù)培養(yǎng)，直至開花。對開花植物的葉片數(shù)和第1朵花開的天數(shù)進行統(tǒng)計，同時在體視顯微鏡下對葉片背面是否有表皮毛的葉片數(shù)目進行統(tǒng)計。將和突變體分別與突變體進行雜交，之后自交分別獲得和的雙重突變體。試驗時間為2019年1月至2021年1月，試驗地點為山西師范大學3號樓植物培養(yǎng)間。

1.2.3 轉基因互補試驗 以野生型8 d幼苗的cDNA作為模板，以基因特異的引物進行PCR擴增，獲得帶有Ⅰ和HⅠ酶切位點的的CDS(coding sequence)；以野生型的DNA作為模板，以基因啟動子特異的引物進行PCR擴增，獲得帶有Ⅰ和Ⅰ酶切位點的基因自身啟動子序列(ATG上游1 080 bp)；用Ⅰ和HⅠ對包含GFP標簽的pCAMBIA1300載體進行雙酶切，與Ⅰ和HⅠ雙酶切的的CDS序列以及Ⅰ和Ⅰ雙酶切的自身啟動子序列進行連接，測序正確后最終獲得p：：(CDS)-GFP的載體構建，引物序列見表1。將構建好的質粒轉入農桿菌GV3101感受態(tài)，通過浸花法對突變體進行轉基因。對轉基因植物進行篩選，直到獲得單拷貝純合轉基因恢復株系，并進行表型的觀察。

1.2.4 蛋白質亞細胞定位觀察 將生長5 d的轉基因恢復植株的根放置到激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation，F(xiàn)V1000S)下，用488 nm的激發(fā)光進行激發(fā)，收集綠色熒光信號。

1.2.5 酵母雙雜交試驗 將和基因的CDS序列分別構建到pGADT7和pGBKT7載體上，將構建好的載體共轉化酵母感受態(tài)細胞，在二缺培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中缺失亮氨酸和色氨酸)上進行篩選，將二缺培養(yǎng)基上生長的單菌落轉移到三缺培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中缺失亮氨酸、色氨酸和組氨酸)進行相互作用的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用Excel 2017對本試驗中的數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 擬南芥naa20突變體表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉變提前和開花提前的表型

為了探究Naa20在植物發(fā)育過程中的作用，我們從ABRC購買到基因的2個T-DNA插入突變體，分別將其命名為和(圖1-A)。轉錄本水平檢測發(fā)現(xiàn)，基因的表達在和突變體中幾乎完全缺失(圖1-B)。對突變體的表型觀察發(fā)現(xiàn)，和突變體均表現(xiàn)出明顯的開花提前的表型(圖1-C和表2)。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，和突變體中幼年態(tài)的葉片和成年態(tài)的葉片數(shù)目均少于野生型(表2)。為了進一步確定突變體的表型是由于基因表達缺失所引起的，將融合GFP標簽的野生型基因轉入突變體中，轉基因株系(Com-3和Com-8)可以恢復突變體幼年態(tài)向成年態(tài)轉變提前和開花時間提前的表型(表2)。以上結果說明，Naa20可以抑制植物從幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變，并且抑制植物過早開花。

表2 不同基因型植株營養(yǎng)生長轉變和開花時間的統(tǒng)計

2.2 Naa20蛋白定位于細胞質

利用融合GFP標簽的轉基因恢復株系對Naa20蛋白的亞細胞定位進行觀察，在擬南芥的根細胞中Naa20蛋白定位在細胞質，這與Naa20共翻譯修飾的功能一致(圖2)。

2.3 Naa20與Naa25具有直接的相互作用

在酵母和人細胞中，Naa20與輔助亞基Naa25形成一個復合體，對底物蛋白進行N末端乙?；揎?，為了探究在擬南芥中Naa20是否與Naa25具有相互作用，進行了酵母雙雜交試驗，結果表明Naa20和Naa25具有直接的相互作用(圖3)，說明Naa20和Naa25存在于同一個復合體中發(fā)揮作用。

2.4 Naa20通過HST調控植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變和開花時間

HST作為microRNA156的轉運蛋白，在其核質轉運過程中發(fā)揮了重要作用。突變體表現(xiàn)出幼年態(tài)向成年態(tài)轉變提前、開花時間提前的表型。為了分析Naa20與HST在遺傳學上的關系，獲得了雙重突變體，雙突變體表現(xiàn)出與hst單突變體相似的表型(圖4和表3)。因此，HST位于Naa20的下游，調控植物發(fā)育時相的轉變。

表3 naa20突變體和hst突變體的表型

3 結論與討論

本研究通過對N末端乙酰轉移酶Naa20的基因突變體進行表型觀察及突變體的轉基因互補試驗，揭示了Naa20抑制植物幼年態(tài)向成年態(tài)的轉變以及開花時間的轉變，在植物發(fā)育時相轉變中發(fā)揮重要的調控作用。已有研究報道表明，Naa20輔助亞基TCU2/Naa25的基因突變體表現(xiàn)出相似的開花時間提前的表型。酵母雙雜交的結果表明，Naa20與Naa25具有直接的相互作用。綜合以上結果表明，Naa20和TCU2/Naa25形成的蛋白質N末端乙酰轉移酶復合體在抑制植物發(fā)育時相轉變中發(fā)揮重要的作用。

遺傳分析表明，Naa20通過下游調控HST進而調控植物發(fā)育時相的轉變。HST是microRNA156核質轉運過程中的重要因子，因此Naa20可能通過控制葉片中microRNA156的水平進而調控植物發(fā)育時相的轉變。因此，蛋白質N末端乙酰轉移酶Naa20作為一個新的調控因子，參與植物發(fā)育時相的轉變，豐富了植物發(fā)育時相轉變的調控層次。