馬 平， 楊 婧， 劉宇卓， 李 銀， 黃欣梅， 趙冬敏， 韓凱凱， 章麗嬌， 劉青濤

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

禽流感病毒屬于正黏病毒科中的甲型流感病毒屬，它由8個分節(jié)段的有包膜的單股負鏈RNA構(gòu)成了全基因組，且每個節(jié)段至少編碼一種蛋白質(zhì)，AIVs共編碼11 種蛋白。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白NS(nonstructural)基因是內(nèi)部基因組中最小的基因節(jié)段，它共編碼NS1和NS2(NEP)2種蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1存在于除病毒顆粒以外的病毒上清或是被感染的細胞體內(nèi)。NS1蛋白在AIVs感染早期主要存在于細胞核中，隨著感染時間的推移，NS1蛋白分布擴散至細胞漿中，并且能刺激機體產(chǎn)生特異性抗NS1蛋白的抗體。NS1的C-末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是與宿主相互作用最頻繁的功能結(jié)合區(qū)，其中，第134～161位氨基酸為其核心序列，該部分序列發(fā)揮了阻斷宿主mRNA剪接、多聚腺苷酸化和核輸出等一系列作用。NS1在病毒-宿主相互關(guān)系中發(fā)揮了極其重要的作用，該病毒成分不僅在AIVs感染宿主過程中能拮抗機體的天然免疫反應(yīng)，而且可以影響流感病毒的致病性和宿主的適應(yīng)性，因此對NS1蛋白的功能、致病性等進行進一步研究至關(guān)重要。

NS1是由流感病毒最后一個節(jié)段的RNA編碼合成，該蛋白含202～237個氨基酸且其大小約為 26 ku，它的結(jié)構(gòu)域包括：N末端1～73個氨基酸構(gòu)成的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端88～202個殘基的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，兩者之間連接區(qū)域為10～15個氨基酸形成的鏈接區(qū)域。NS1蛋白是一種從病毒和宿主兩方面進行調(diào)節(jié)的多功能調(diào)控蛋白，從病毒方面來講，NS1蛋白通過提高流感病毒的翻譯能力，提高病毒對宿主的抗病毒反應(yīng)從而直接性地增強流感病毒的致病作用；從宿主方面來講，NS1蛋白可通過拮抗干擾素、調(diào)控宿主細胞凋亡、抑制宿主細胞蛋白的合成等方式來減弱宿主機體的抗病毒反應(yīng)從而間接性地增強病毒的致病作用。因此，對蛋白功能的拮抗能夠降低甲型流感病毒的復(fù)制效率和限制病毒傳播空間，具有良好的應(yīng)用價值。

本研究于2019—2021年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所對的基因特性進行了分析，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-，并在BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行優(yōu)化表達，對表達的重組蛋白進行分析和純化后通過Western-blot和免疫熒光來鑒定，為后續(xù)疫苗研發(fā)及診斷方法的探究奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體和菌株

H9N2亞型禽流感病毒和pET32a原核表達載體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病實驗室保存；DH5α和BL21感受態(tài)細胞購自南京擎科生物科技有限公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

QuickCutⅠ和QuickCutRⅠ限制性核酸內(nèi)切酶，購自TaKaRa公司；5 000 bp DNA Marker，購自諾唯贊生物科技有限公司；核酸提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小提試劑盒，均購自美國Axygen公司；鎳離子親和層析蛋白純化試劑盒和His-tag抗體，均購自碧云天生物公司；辣根過氧化氫酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank庫里的全基因序列，針對編碼區(qū)設(shè)計1對特異性引物，引物兩端分別引入Ⅰ(堿基序列為CTCGAG)、RⅠ(堿基序列為GAATTC)酶切位點，此引物送至金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列：F：5′-C A A A G A A T T C A T G G A T T C C A A C A C T-3′(含RⅠ酶切位點)，R：5′-T T T C C T C G A G C T A C T T T G G A G A A A-3′(含Ⅰ 酶切位點)。

1.4 目的基因的擴增與克隆

利用RNA提取試劑盒提取H9N2 AIVs的基因組，以提取的基因組為模板，用引物R進行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物為cDNA，作為PCR擴增的模板。PCR擴增體系為50 μL，2×Mix 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 3 μL，超純水20 μL。擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收純化陽性片段，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行序列測定，篩選出含有保真序列的基因的克隆。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將篩選到的保真質(zhì)粒pMD18-T-NS1與表達載體PET32a進行雙酶切，分別電泳鑒定并回收PET32a酶切質(zhì)粒和基因片段，將兩者在16 ℃連接30 min后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單克隆菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定。

1.6 NS1蛋白的誘導(dǎo)條件優(yōu)化

為摸索蛋白誘導(dǎo)表達的最佳條件，將構(gòu)建成功的PET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達感受態(tài)細胞BL21中，鑒定為陽性的菌株進行擴大培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至0.6～1.0，分別以不同濃度的TPTG和不同誘導(dǎo)時間來進行優(yōu)化，根據(jù)SDS-PAGE的結(jié)果，確定最佳優(yōu)化條件。

1.6.1 IPTG最佳濃度的探索 在5管為0.6～1.0的4 mL菌液中加入不同量的IPTG使其終濃度分別為0.0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L，37 ℃，120 r/min 誘導(dǎo)6 h，誘導(dǎo)結(jié)束后，8 000 r/s離心 10 min，棄上清，1×PBS洗滌3遍后用480 μL PBS重懸，取樣本進行SDS-PAGE分析，根據(jù)結(jié)果確定IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度。

1.6.2 最佳誘導(dǎo)時間的探索 在培養(yǎng)基中加入終濃度為2.0 mmol/L IPTG，分別誘導(dǎo)2、4、6、8 h，對樣品進行SDS-PAGE檢測，根據(jù)電泳結(jié)果確定出最佳誘導(dǎo)時間。

1.7 重組蛋白的可溶性分析及純化

挑取陽性單克隆于4 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，第2天以1 ∶100的比例擴大培養(yǎng)至菌液為0.6～1.0，加入終濃度為2 mmol/L的IPTG，37 ℃、120 r/min誘導(dǎo)表達8 h后8 000 r/s離心 10 min，棄上清，沉淀用PBS反復(fù)洗滌3次，重懸于480 μL PBS中，間歇超聲波冰浴破菌后，12 000 r/s 離心10 min，分別對上清和沉淀進行 SDS-PAGE 檢測。根據(jù)可溶性分析的結(jié)果，按照碧云天純化試劑盒的步驟對蛋白進行純化。

1.8 純化蛋白的Western blot分析

將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后加入含5%脫脂奶粉的PBST在37 ℃培養(yǎng)箱中封閉 2 h，后與1 ∶1 000稀釋的His單克隆抗體4 ℃反應(yīng)過夜，用PBST洗滌3次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在37 ℃溫箱中反應(yīng)1 h，用PBST洗滌3次后顯色，進行免疫印記分析。

1.9 純化蛋白的免疫原性分析

采用純化的NS1重組蛋白多次免疫小鼠制備血清，以其作為一抗對感染H9N2禽流感病毒8 h 的MDCK細胞進行免疫熒光試驗，測定所制備的血清能否識別H9N2禽流感病毒在MDCK細胞復(fù)制過程中產(chǎn)生的NS1蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS1基因的RT-PCR擴增與保真克隆的篩選

提取H9N2 AIVs的基因組，用NS1引物進行RT-PCR擴增，由圖1可知，該試驗擴增出與預(yù)期大小一致的片段。將該片段進行膠回收后將產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，通過序列測定篩選出保真基因克隆。

2.2 重組表達質(zhì)粒的PCR與雙酶切鑒定結(jié)果

對克隆質(zhì)粒pMD18-T-進行雙酶切，將切下的基因連接到原核表達載體pET32a，然后對重組表達質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定。由圖2可知，基因成功連接到質(zhì)粒pET32a，重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET32a-。

2.3 NS1蛋白表達條件的優(yōu)化

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a-轉(zhuǎn)化至表達感受態(tài)BL21(DE3)，分別對IPTG的使用濃度和誘導(dǎo)時間進行最佳條件探索。由圖3、圖4可知，最佳IPTG的使用濃度為2 mmol/L，最佳誘導(dǎo)時間為8 h。

2.4 表達產(chǎn)物的可溶性分析

確定重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達條件后，對重組蛋白進行大量表達，并對表達產(chǎn)物的可溶性進行分析。由圖5可知，重組蛋白主要存在于細胞裂解沉淀中， 即NS1重組蛋白在細胞中主要以包涵體的形式存在。

2.5 NS1重組蛋白的純化與鑒定

由圖6可知，將收集的包涵體用裂解液進行溶解，用鎳離子親和層析柱對溶解上清中的重組蛋白進行純化，并對純化后的重組蛋白進行Western-blot鑒定。由圖7-A可知，重組蛋白可以被抗His標(biāo)簽的單抗識別，提示NS1重組蛋白表達、純化成功。

2.6 重組蛋白的免疫原性分析

采用純化的NS1重組蛋白多次免疫小鼠制備血清，采用該抗體對感染H9N2 AIV的MDCK細胞進行免疫熒光試驗。由圖7-B可知，所制備的多克隆抗體可以識別H9N2 AIV感染MDCK細胞后所產(chǎn)生的的NS1蛋白，提示本試驗所表達、純化的NS1重組蛋白具有良好免疫原性。

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒是最常見的低致病性禽流感病毒，最早于1966年從北美的火雞體內(nèi)分離到；我國于1994年在廣東某一雞場首次分離出H9亞型禽流感病毒；隨后，該型禽流感在我國養(yǎng)禽地區(qū)呈大流行趨勢。流行病學(xué)調(diào)查顯示，H9亞型禽流感病毒的主要宿主是野生水禽，而家養(yǎng)水禽和雞對H9N2 AIVs也易感，這些宿主在H9N2 AIVs向哺乳動物的跨物種傳播中發(fā)揮重要作用。自1999年以來，我國不斷有報道人感染H9N2亞型禽流感病毒的病例，這使H9N2亞型禽流感受到廣泛關(guān)注和高度重視。H9N2亞型禽流感病毒不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成極大損失，也嚴重威脅到人類健康，所以對H9N2亞型禽流感病毒的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。NS1是甲型流感病毒的一種非結(jié)構(gòu)多功能調(diào)節(jié)蛋白，在流感病毒的致病性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，對NS1蛋白進行深入研究有助于更好地理解流感病毒與宿主細胞間的相互作用，為揭示禽流感病毒的致病分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究利用RT-PCR技術(shù)擴增出H9N2 AIVs的基因片段，連接pMD18-T載體進行克隆，然后將克隆的保真基因與載體pET32a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達，確定最優(yōu)的誘導(dǎo)表達條件，利用His-tag鎳柱純化重組蛋白，利用SDS-PAGE和Western-blot進行鑒定。結(jié)果顯示，采用pET32a載體可在感受態(tài)BL21(DE3)中進行NS1蛋白的表達，NS1蛋白的表達量與誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間有一定相關(guān)性，當(dāng)IPTG濃度為2 mmol/L、誘導(dǎo)時間為8 h時，NS1融合蛋白的表達量最大。由于pET32a帶有His標(biāo)簽，所以本研究對融合蛋白用鎳柱進行了純化，并對純化的融合蛋白用針對His標(biāo)簽的單克隆抗體進行了鑒定，結(jié)果表明融合蛋白可以與His單抗進行結(jié)合。而免疫熒光試驗結(jié)果顯示，利用純化的重組蛋白制備的多克隆抗體可識別H9N2 AIVs在宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生的NS1蛋白。以上結(jié)果說明，本研究成功表達和純化了H9N2禽流感病毒的NS1蛋白，并且重組NS1蛋白具有良好的免疫原性，這為下一步研究NS1蛋白的功能，以及以NS1蛋白為靶標(biāo)的禽流感病毒臨床感染的診斷和抗病毒藥物的研制奠定了基礎(chǔ)。