康紹建 趙琪鐘 侯安國

1.云南省食品藥品審核查驗中心，云南 昆明 650011；2.普洱市藥品檢驗檢測中心，云南 普洱 665000；3.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500

泌尿系統(tǒng)感染通常指腎臟、輸尿管、膀胱、尿道各個部位感染的總稱,嚴重威脅人類健康[1-2],尿路感染是繼呼吸系統(tǒng)及消化道之后的第三位感染性疾病?？肆芡z囊由頭花蓼(四季紅)、黃柏等二味藥制成，具有清熱解毒、利濕通淋作用,臨床上常用于治療泌尿系統(tǒng)感染。對頭花蓼的藥理研究[3-4]表明,其對泌尿系統(tǒng)感染有抗菌作用，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀是黃柏的主要化學成分，其鹽酸小檗堿具有抑制炎癥反應[5-8]、抗病原微生物的作用[9-11],巴馬汀也具有抗炎作用[12-13],這些作用皆與克淋通膠囊用藥功效一致?？肆芡z囊原標準[標準號：WS-11282-(ZD-1282)-2002]中僅有頭花蓼的薄層鑒別和鹽酸小檗堿的HPLC法含量測定，故為了更好地控制此膠囊劑的質量，對其質量標準進行提升研究，本試驗在克淋通膠囊原標準中增加了黃柏和關黃柏的薄層鑒別，同時采用HPLC法建立了頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測定方法[14-20]，為克淋通膠囊的質量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 The Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀；PM4-1300TL超聲儀；UV-2550紫外可見分光光度計；Sartorius CPA225D電子分析天平(十萬分之一)；Sartorius BS224S電子分析天平(萬分之一)。

1.2 試藥 克淋通膠囊由貴州聯(lián)盛藥業(yè)有限公司提供(批號1402100、1402110、1402120、1402130、1402150)。沒食子酸對照品(110831-201605)(含量以90.8%計)；關黃柏對照藥材(批號:120937-201408)；黃柏對照藥材(批號：121510-201606)；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201814)；鹽酸巴馬汀對照品(批號：110732-201913)均由中國食品藥品檢定研究院提供。實驗用甲醇、乙腈為色譜純、由美國默克公司生產(chǎn)；水為純凈水；甲醇、磷酸等其它試劑均為分析純。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠、默克股份兩合公司)。

2 方法與結果

2.1 黃柏薄層鑒別 稱取供試品粉末0.2 g，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液25 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g，按上述方法制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品適量，加鹽酸-甲醇混合溶液(1∶100)制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典通則0502 )試驗，吸取上述對照藥材溶液、對照品溶液及供試品溶液各1～3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲醇-異丙醇-水(6∶3∶2∶1.5∶0.3)為展開劑，點板展開，晾干后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果表明，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。結果如圖1所示。

1.克淋通膠囊(批號:1402100);2.克淋通膠囊(批號：1402110);3.克淋通膠囊(批號：1402120);4.鹽酸小檗堿對照品(110713-201814);5.黃柏對照藥材(121510-201606);6.陰性樣品(缺黃柏);T= 22.7 ℃ RH=68.4%圖1 黃柏薄層鑒別圖

2.2 關黃柏薄層鑒別 精密稱取供試品粉末 0.1 g，加甲醇10 mL，加熱回流15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取關黃柏對照藥材0.1 g，按上述方法制成對照藥材溶液。再取鹽酸巴馬汀對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取關黃柏供試品溶液1～2 μL，對照品溶液、對照藥材溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑，點板展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，無相同顏色的熒光斑點出現(xiàn)。結果如圖2所示。

1.黃柏對照藥材(121510-201606);2.克淋通膠囊(批號：1402100);3.關黃柏對照藥材(120937-201408);4.克淋通膠囊(批號：1402110);5.鹽酸小檗堿對照品(110713-201814);6.克淋通膠囊(批號：1402120);7.鹽酸巴馬汀對照品(110732-201913);T= 22.0 ℃ RH=65.4%圖2 關黃柏薄層鑒別圖

2.3 含量測定(頭花蓼)

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.1%磷酸(5∶95)為流動相；流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30 ℃，檢測波長為216 nm，進樣體積 10 μL。理論板數(shù)按沒食子酸峰計，應不低于2500。

取適量的沒食子酸對照品，以50%甲醇溶液稀釋，紫外-可見分光光度計選擇在200～400 nm波長范圍進行光譜掃描，根據(jù)其光譜圖，沒食子酸對照品最大吸收波長為216 nm，因此該方法檢測波長確定為216 nm。

2.3.2 對照品溶液 精密稱取沒食子酸對照品11.68 mg，至50 mL棕色容量瓶中，加50% 甲醇溶液溶解并稀釋至刻度。精密吸取5～50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液 精密稱取取本品內(nèi)容物 0.2 g，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密移取50%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液 根據(jù)處方制備不含頭花蓼的陰性樣品，按“2.3.3”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3.5 專屬性試驗 依據(jù)“2.3.1”項下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，測定。結果表明，在與對照品溶液色譜圖相應保留時間處，供試品溶液有沒食子酸特征吸收峰，而陰性對照液無相應吸收峰，表明專屬性良好。如圖3～5所示。

圖3 沒食子酸對照品圖

圖4 陰性樣品圖

圖5 克淋通膠囊樣品圖

2.3.6 線性關系的考察 精密吸取沒食子酸對照品溶液(0.02121 mg/mL)2、5、10、15、20、30 μL進樣，記錄高相液相色譜，以沒食子酸峰面積為橫坐標，以進樣量(μg)為縱坐標作圖，得回歸方程為：Y=0.0001X-0.0002(r2=1)，沒食子酸在0.04242～0.6363 μg之間線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 精密吸取沒食子酸對照品溶液(0.02121 mg/mL)10 μL，連續(xù)進樣6次，測定沒食子酸峰面積，結果峰面積RSD=0.59%，說明儀器精密度良好。

2.3.8 重復性考察 取同一批號(批號:1402100)樣品6份,按上述“2.3”項下供試品溶液制備方法,平行處理并測定,結果6 次測得沒食子酸平均含量為2.8558 mg/g，RSD=1.25%；表明重復性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性考察 按上述“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，室溫條件下每2小時進樣1次，以峰面積計算， RSD為1.48%(n=7)；結果表明室溫條件下，供試品溶液中芍藥苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.10 準確度考察 精密稱取6份已知濃度(2.8558 mg/g)供試品(批號1402100)各0.1 g，裝入具塞錐形瓶中，各自精密加入沒食子酸對照品溶液(濃度0.01818 mg/mL)15 mL,按上述“2.3.3”項下方法制備所需溶液，照含量測定方法項下操作，測定供試品溶液中沒食子酸的含量，計算沒食子酸的平均回收率為99.76%，RSD為0.25%。上述結果表明該方法準確度良好。見表1。

表1 準確度試驗結果

2.3.11 含量測定 按上述色譜條件，依法測定5批樣品中沒食子酸的含量。結果如下表2。

表2 5批樣品含量測定結果

3 討論

本試驗采用TLC法對克淋通膠囊中黃柏和關黃柏進行了定性鑒別，其結果分離度好，專屬性強。同時通過HPLC法建立了克淋通膠囊頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測定方法，經(jīng)過HPLC方法學考察以及對5批克淋通膠囊樣品進行含量測定，結果表明本方法準確，專屬性強，可作為克淋通膠囊頭花蓼(四季紅)中沒食子酸的含量測定方法[21-22]。

3.1 提取溶劑的選擇 采用稀乙醇，30%甲醇,50%甲醇為提取溶劑，試驗結果表明，當提取溶劑為50%甲醇時，提取效果最好，故選用50%甲醇。

3.2 提取方法的選擇 預實驗通過對50%甲醇超聲提取30 min、加熱回流提取30 min、索氏提取 2 h 及3 h比較，其中索氏提取2 h所得含量最低，索氏提取3 h所得含量接近超聲提取30 min和加熱回流提取30 min；超聲提取效果較好且簡便快捷，故選用超聲提取方法。

3.3 提取時間的選擇 實驗通過對50%甲醇超聲提取10 min 、15 min、30 min比較，實驗表明超聲提取15 min和超聲提取30 min所得含量測定值接近；故選用超聲提取15 min。

3.4 流動相的選擇 預實驗時分別以乙腈-甲酸、乙腈-水，甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相進行考察，結果表明，甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時，所得色譜圖峰形好，分離效果好。故本研究選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相。

3.5 柱溫的選擇 預實驗分別以20、25、30 ℃為柱溫進行考察。為減少時間且分離效果較好，故本研究柱溫選擇30 ℃。

綜上所述，在克淋通膠囊現(xiàn)行質量標準的基礎上增加了黃柏和關黃柏的薄層鑒別方法及有效成分指標沒食子酸的含量測定，方法簡單易行，為完善和提高克淋通膠囊的質量標準提供了科學依據(jù)。