張維明 李立紀 陶 劍 陳得玲 唐世朗

1. 昆明學院醫(yī)學院，云南 昆明 650214；2.昆明市醫(yī)學科學研究所，云南 昆明 650041

豆腐果苷(Helicid，結(jié)構(gòu)式如圖1所示)為山龍眼科植物深綠山龍眼(HelicianilagiricaBedd)的干燥果實(豆腐渣果)的活性成分之一，豆腐渣果廣泛分布于云南西南部和南部(西雙版納、普洱、保山、紅河)等地，資源豐富，在云南西雙版納地區(qū)是獨具民族特色和地區(qū)特色的傣醫(yī)常用解毒藥，可用于解農(nóng)藥和食物中毒[1]。目前對豆腐渣果的研究集中于其主要活性成分豆腐果苷，豆腐果苷是一種天然阿洛糖酚苷類化合物，其獨特性在于結(jié)構(gòu)中的糖基為稀有的吡喃阿洛糖，臨床及藥理活性研究[2]表明，豆腐果苷具有肯定的止痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用，對神經(jīng)衰弱綜合征有較好的療效，目前已開發(fā)出以之為主要成分的藥物“神衰果素片”上市并銷售，臨床主要用于緩解神經(jīng)官能癥的頭痛、頭昏及睡眠障礙。豆腐果苷的結(jié)構(gòu)與蘭科植物天麻的活性成分天麻素相似，有研究[3]表明，豆腐果苷與天麻素在家兔體內(nèi)具有相互作用，但相較于天麻素，對豆腐果苷活性的研究相當不足，其它藥理作用研究非常少，形成了豆腐渣果及豆腐果苷主治單一的印象，嚴重影響了豆腐渣果的進一步開發(fā)和利用。對于豆腐渣果作為傣醫(yī)常用解毒藥的作用及機制則未見研究報道。

圖1 化合物豆腐果苷的化學結(jié)構(gòu)圖

課題組前期在對豆腐渣果進行“解酒毒”的研究中發(fā)現(xiàn)，豆腐渣果提取物及活性成分豆腐果苷對小鼠酒精中毒性腦損傷模型具有保護作用，可減輕酒精中毒造成的腦內(nèi)炎癥(另文發(fā)表)。近年來的研究[4]發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)過度的炎癥反應是缺血性腦卒中患者繼發(fā)性神經(jīng)損傷、認知障礙的重要原因之一，抑制腦內(nèi)炎癥反應是缺血性腦卒中治療的有效策略。為進一步探討豆腐渣果活性成分豆腐果苷的藥理活性，并驗證豆腐果苷是否可減輕缺血性腦卒中后腦內(nèi)炎癥，故進行了本實驗的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豆腐果苷具有較好的抗血栓形成及減輕腦內(nèi)炎癥的作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物 健康SD大鼠，雄性，體重240～280 g，由四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號：SCXK(川)2013-24；批號：0018160。

1.2 藥物與材料 豆腐果苷，純度99%，購自北京百靈威；花生四烯酸、地塞米松、吐溫-80、水合氯醛(分析純)購自天津市瑞金特化學品有限公司。大鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor -α，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β) 、ELISA 試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；大鼠血栓烷B2(ThromboxaneB2，TXB2)、6-keto-PGF1α、半胱氨酰白三烯(Cysteinyl Leukotrienes，CysLTs)、白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4 )ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 實驗方法

2.1 豆腐果苷對大鼠下腔靜脈血栓形成的影響 將健康雄性SD大鼠隨機分為4組：模型組(給予生理鹽水)、陽性對照組(給予氯吡格雷，20 mg/kg 體重)、豆腐果苷高劑量組(給予50 mg/kg體重)、豆腐果苷低劑量組(給予10 mg/kg體重)，所有動物均連續(xù)灌胃給予相應受試物5 d，1次/d，末次給藥后30 min，參考相關文獻[5-6]方法，復制大鼠下腔靜脈血栓模型，簡述如下：所有大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹部正中切口，分離下腔靜脈，用細絲線結(jié)扎，縫合腹腔，結(jié)扎4 h后，過量麻醉處死大鼠，打開腹腔，在結(jié)扎位置下方2 cm處用動脈夾夾閉下腔靜脈管腔，將結(jié)扎段血管剪下，眼科剪剖開血管，取出血栓放于濾紙上，吸干血液，用微量電子天平稱取血栓濕重。

2.2 豆腐果苷對花生四烯酸誘導大鼠腦血栓形成的影響 動物分組及給藥同2.1，末次給藥后30 min，參考相關文獻[7]方法，復制花生四烯酸誘導大鼠腦血栓形成模型。簡述如下：大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，分離右頸總動脈，結(jié)扎其頸外動脈分支和頸總動脈向心端，于遠心端插入三通管，手術(shù)結(jié)束5 min后，經(jīng)三通管向右頸總動脈以0.1 mL/100g體重注入0.5 mg/kg的花生四烯酸，5 min后從三通管內(nèi)注入0.2%伊文思藍0.5 mL/100 g體重，注射后5 min，過量麻醉處死動物，取出大腦，左右腦分別稱取濕重，分別置勻漿器中，加入5 mL體積比為3∶7的0.5% Na2SO4及丙酮的混合液，制成腦勻漿液，密閉靜置90 min，3000 rpm離心10 min，取上清液在620 nm處測吸光度，以栓塞側(cè)腦半球吸光度與其腦組織重量的比值表示伊文思藍的含量。

2.3 豆腐果苷對花生四烯酸誘導大鼠腦血栓模型腦內(nèi)炎癥因子的影響 將健康雄性SD大鼠50只，隨機分為5組，分別為假手術(shù)組(給予生理鹽水)、模型組(給予生理鹽水)、陽性對照組(給予地塞米松，20 mg/kg 體重)、豆腐果苷高(50 mg/kg體重)、低劑量組(10 mg/kg體重)，所有動物均采用灌胃給藥，各組動物連續(xù)給予相應受試物5 d，1次/d，末次給藥后30 min，同2.2復制花生四烯酸誘導大鼠腦血栓模型，于右頸總動脈注入花生四烯酸3 h后，迅速處死動物，取出并分離右側(cè)大腦，每100 mg腦組織加入1 mL PBS制成腦組織勻漿，將勻漿液4 ℃ 5000 rpm離心5 min，取上清液，ELISA試劑盒檢測腦勻漿中TNF-α、IL-1β、TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4的含量。

3 結(jié)果

3.1 豆腐果苷對大鼠靜脈血栓形成的影響 豆腐果苷高、低劑量均能減輕大鼠下腔靜脈血栓濕重，提示豆腐果苷具有顯著的抑制大鼠下腔靜脈血栓形成作用。見表1。

表1 豆腐果苷抗大鼠下腔靜脈血栓形成的作用

3.2 豆腐果苷對花生四烯酸誘導大鼠腦血栓形成的影響 豆腐果苷高、低劑量均能明顯減少大鼠栓塞側(cè)腦組織中伊文思藍含量，提示豆腐果苷可顯著抑制花生四烯酸誘導的大鼠腦血栓形成，減輕由腦血栓形成造成的血腦屏障破壞。詳見表2。

表2 豆腐果苷對花生四烯酸致大鼠腦血栓形成模型腦組織伊文思藍含量的影響

3.3 豆腐果苷對花生四烯酸誘導大鼠腦血栓模型腦內(nèi)炎癥的影響 花生四烯酸注入大鼠腦內(nèi)導致了大量炎癥因子釋放，給予高劑量豆腐果苷后明顯降低了大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，說明豆腐果苷可減輕急性腦血栓形成后腦內(nèi)的炎癥；豆腐果苷對腦組織TXB2和6-keto-PGF1α含量無明顯影響，但可降低CysLTs、LTB4的含量，提示豆腐果苷減輕腦內(nèi)炎癥的作用與抑制花生四烯酸代謝的5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase，5-LOX)途徑有關，而與其環(huán)氧合酶途徑(Cyclooxygenase，COX)無關。詳見表3、4、5。

表3 豆腐果苷對花生四烯酸致大鼠腦血栓模型腦組織TNF-α、IL-1β的影響

表4 豆腐果苷對花生四烯酸致大鼠腦血栓模型腦組織TXB2和6-keto-PGF1α的影響

表5 豆腐果苷對花生四烯酸致大鼠腦血栓模型腦組織CysLTs和LTB4的影響

4 討論

2019年，由中國疾病預防控制中心與美國華盛頓大學合作完成的最新中國疾病負擔結(jié)果報告中顯示，自1990～2017年，中國居民疾病譜發(fā)生了重大的變化，年齡校正的中風死亡率下降了33.5%，但即使如此，中風仍然是中國人死亡的第一殺手[8]。缺血性腦卒中是臨床卒中的主要類型，頸總動脈粥樣硬化斑塊脫落引起的血栓形成是導致缺血性腦卒中的重要原因之一。因此，抑制血栓形成是防治缺血性腦卒中的重要措施。

課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，豆腐果苷具有明顯的體外抑制血栓形成的作用，結(jié)合血栓形成在缺血性疾病中的關鍵作用，為進一步闡明豆腐果苷潛在的抗血栓藥理活性，實驗采用了兩種病理機制的血栓動物模型考察豆腐果苷體內(nèi)抗血栓形成作用。對結(jié)扎大鼠下腔靜脈導致血流瘀滯所形成的靜脈血栓模型，豆腐果苷表現(xiàn)了顯著的減輕血栓重量的作用，提示其具有抑制靜脈血栓形成的作用，可能在抑制深靜脈血栓形成中也具有一定的效果，值得進一步研究?；ㄉ南┧犷i內(nèi)動脈注射是誘導急性腦血栓形成的常用模型，大鼠頸內(nèi)動脈注射花生四烯酸后，可迅速在腦內(nèi)形成大量血栓，造成急性腦缺血損傷，同時可引起血腦屏障通透性的升高，此時給動物尾靜脈注射生物染料伊文思藍后，損傷側(cè)腦組織中伊文思藍滲入量可明顯增加，提前給予豆腐果苷干預后，顯著減少了大鼠腦組織中伊文思藍的含量，提示其具有降低因腦內(nèi)大量血栓形成而造成的血腦屏障通透性升高的作用，說明豆腐果苷對急性腦缺血損傷有較好的血腦屏障保護作用。大量研究已證實，缺血性腦卒中后腦內(nèi)的炎癥反應是造成血腦屏障破壞、腦內(nèi)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷的重要原因，抑制缺血性腦卒中后腦內(nèi)炎癥反應對改善中風的預后具有積極的作用。本實驗的結(jié)果可知，大鼠頸內(nèi)動脈注射花生四烯酸誘導血栓形成后，腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β顯著升高，說明腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥反應，給予豆腐果苷后可降低模型動物腦組織中炎癥因子TNF-α和IL-1β 的含量，提示豆腐果苷具有減輕急性腦缺血后腦內(nèi)炎癥反應的作用。花生四烯酸誘導的炎癥反應具有兩條經(jīng)典途徑，一為環(huán)氧合酶介導的炎癥反應，其產(chǎn)物為前列腺素類，阿司匹林為該途徑的選擇性抑制劑。另一條為5-脂氧合酶介導的炎癥反應，其產(chǎn)物為白三烯類，齊留通為該途徑的選擇性抑制劑。為探討豆腐果苷減輕炎癥是通過哪條途徑而達到，故對兩條途徑下游的炎癥介質(zhì)進行了含量測定，結(jié)果顯示，豆腐果苷可降低5-脂氧合酶介導白三烯類產(chǎn)物CysLTs和LTB4的含量，說明豆腐果苷可抑制由白三烯介導的炎癥反應，LTB4是目前已知的體內(nèi)最強的趨化因子，可趨化大量炎癥細胞進入腦內(nèi)，造成繼發(fā)性的神經(jīng)炎癥損傷，豆腐果苷可降低LTB4的含量，這對于減少炎癥細胞浸潤，進而減輕繼發(fā)性的神經(jīng)炎癥損傷具有積極的意義?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)氧合酶途徑代謝的產(chǎn)物是血栓素A2和前列腺環(huán)素，由于它們穩(wěn)定性低，故本實驗中測定了它們的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α，結(jié)果顯示豆腐果苷對它們的含量均無明顯影響，提示其對花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶代謝的途徑?jīng)]有明顯影響，同時也說明豆腐果苷對花生四烯酸誘導的炎癥反應具有選擇性抑制作用，這與另一研究報道[9]的天麻活性成分對羥基苯甲醛的抗炎作用不同，羥基苯甲醛對花生四烯酸的環(huán)氧合酶途徑炎癥反應具有明顯的作用，而對5-脂氧合酶途徑作用不明顯。提示在后續(xù)的研究中，有必要對豆腐果苷抗炎作用的構(gòu)效關系進行深入研究。

綜上所述，研究證實了傣藥豆腐渣果的活性成分豆腐果苷抗血栓形成和抑制急性腦血栓動物模型腦內(nèi)炎癥的新活性，為拓展豆腐果苷及神衰果素片的臨床新用途提供了科學依據(jù)，但其深入的作用機制有待進一步研究。