閻雅寧，曹曉云，郭福慶

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

1 儀器與試藥

1.1 試驗儀器及設備 恒溫培養(yǎng)箱（BINDER KB720），滅菌鍋（Sanyo MLS-3780），超凈工作臺（yamato ADS161），生物安全柜（BAKER SG-403A TX-INT），自動無菌檢測儀（MILLIPORE），集菌培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術股份有限公司）。

1.2 驗證用菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（F）98001］、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64941］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］均購自中國食品藥品檢定研究院，由本院傳代保存。

1.3 樣品 抽樣來自甲、乙、丙3個生產(chǎn)企業(yè)的注射用鹽酸地爾硫（規(guī)格：10 mg），共34個批次樣品。

1.4 驗證用培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號190301）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號190327）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號190304）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號180724）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司，批號181127）、蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20181106）、聚山梨酯80（天津市華東試劑廠，批號2018年01月19日）、氯化鈉（天津市帆船化學試劑科技有限公司，批號2019年03月22日）。以上市售脫水培養(yǎng)基均按標簽說明配制并高壓滅菌后備用。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 菌液配制與計數(shù) 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)24 h；白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，22.5℃培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)物各1 ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成不大于100 cfu/ml的菌懸液。黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，22.5℃培養(yǎng)7 d，使大量孢子成熟，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋成不大于100 cfu/ml的孢子懸液。取上述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、和生孢梭菌3種菌適宜稀釋級的試驗菌懸液1 ml注入到無菌平皿中，并立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，其中生孢梭菌置厭氧罐中，置32.5℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)；取上述白色念珠菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉3種菌適宜稀釋級的試驗菌懸液1 ml注入到無菌平皿中，并立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，置22.5℃培養(yǎng)72 h，計數(shù)。

2.2 預試驗

表1 3種預試驗方法

2.2.2 預試驗結(jié)果 通過試驗結(jié)果的觀察，抽取的3個生產(chǎn)企業(yè)的樣品按照表1方法C進行預試驗時，金黃色葡萄球菌在規(guī)定時間內(nèi)都能夠產(chǎn)生菌落。陰性對照在規(guī)定時間內(nèi)均無菌生長。使用方法A和方法B均不能都生長出菌落。結(jié)果見表2。

表2 3家生產(chǎn)企業(yè)3種預試驗方法的結(jié)果

2.3 無菌方法適用性試驗

2.3.1 試驗組 先用少量0.1%無菌蛋白胨溶液潤濕濾膜，取供試品10支，溶于100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，全量濾過至一個濾器中，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，在最后一次沖洗液中在加入少于100 cfu的試驗菌，濾干。將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml加至濾器內(nèi)，32.5℃培養(yǎng)3 d；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml加至濾桶內(nèi)，22.5℃培養(yǎng)5 d。各需驗證試驗菌同法操作。

2.3.2 菌液對照組 取一只裝有同體積的培養(yǎng)基濾器，將100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液全量濾過，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，在最后一次沖洗液中在加入與試驗組等量的試驗菌，作為菌液對照組。按規(guī)定溫度培養(yǎng)5 d。各試驗菌同法操作。

2.3.3 陰性對照組 另取一只裝有同體積的培養(yǎng)基濾器，將100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液全量濾過，用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml分3次沖洗，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基各100 ml分別加至濾器內(nèi)，作為陰性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d。

2.4 無菌檢查 按照“2.3”項下方法取規(guī)定量供試品，溶于適量的0.9%無菌氯化鈉溶液中，平均過濾至3個濾器中，用0.1%無菌蛋白胨溶液900 ml分3次沖洗，其中兩個濾器中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100 ml，另一個濾器中加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml，其中一個硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌，作為陽性對照。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的濾器置于32.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的濾器置于22.5℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，均培養(yǎng)14 d。依法檢查，應符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。

3 結(jié)果

3.1 方法適用性試驗結(jié)果 按照“2.3”項下的試驗方法對3家生產(chǎn)企業(yè)的樣品進行方法適用性試驗，結(jié)果表明，《中國藥典》規(guī)定的各試驗菌均在規(guī)定的時間內(nèi)能夠正常生長，該試驗方法適用于注射用鹽酸地爾硫的無菌檢查。結(jié)果見表3。

表3 3家企業(yè)生產(chǎn)的注射用鹽酸地爾硫無菌方法適用性試驗結(jié)果

表3 3家企業(yè)生產(chǎn)的注射用鹽酸地爾硫無菌方法適用性試驗結(jié)果

注：+表示有菌落生長；-表示無菌落生長

生產(chǎn)企業(yè)甲乙丙試驗菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉金黃色葡萄球菌大腸埃希菌生孢梭菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉天數(shù)（d）1 2 3+++++++++--+--+--++++++++++--+--+--++++++++++--+--+--+4++++++++++++++++++5++++++++++++++++++

3.2 無菌檢查結(jié)果 按照“2.4”項下的試驗方法對抽取的34批次樣品進行無菌檢查，培養(yǎng)14 d后，均無菌生長，結(jié)果均符合規(guī)定。

4 討論

4.1 無菌方法學適用性試驗條件考查 在無菌方法適用性試驗的預試驗中發(fā)現(xiàn)，注射用鹽酸地爾硫有一定的抑菌性，選取了3個生產(chǎn)企業(yè)的3批樣品進行方法學適用性試驗，對比了3種試驗方法A、B、C，試驗得出方法C用0.1%無菌蛋白胨溶液300 ml沖洗能有效地去除藥品中的抑菌成分，該方法適用于注射用鹽酸地爾硫的無菌檢查。

4.2 抽驗結(jié)果及市場情況考查 本次國評試驗抽取3個生產(chǎn)企業(yè)共34批次樣品，涉及4個批準文號，供樣單位涉及全國16個省市自治區(qū)。因此，對其進行檢驗和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，可以較好地反映目前國產(chǎn)注射用鹽酸地爾硫的質(zhì)量現(xiàn)狀和市場情況。在執(zhí)行標準方面，一共涉及4個執(zhí)行標準，其中2批次執(zhí)行標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準》YBH07902005及《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準》WS1-（X-015）-2010Z-2015，2批次執(zhí)行標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準》YBH07902005，1批次執(zhí)行標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準》WS1-（X-015）-2010Z-2015，29批次執(zhí)行標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理總局進口藥品注冊標準》JX20150001。各標準的無菌檢查方法均參照《中國藥典》2015年版四部通則無菌檢查法的要求，根據(jù)各自的執(zhí)行標準進行無菌檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。此次抽驗結(jié)果說明注射用鹽酸地爾硫在流通運輸?shù)拳h(huán)節(jié)穩(wěn)定可靠，抽驗的生產(chǎn)企業(yè)對該藥品的原料采集、制備、工藝和生產(chǎn)等環(huán)節(jié)及藥品的質(zhì)量安全方面相對穩(wěn)定。