耿冶飛，陳秀杰，龔亞飛，婁 靖

（鶴壁市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 458030）

蓽鈴胃痛顆粒由蓽澄茄、延胡索（醋制）、大黃（酒制）、黃連、吳茱萸等藥材組成，具有行氣活血、和胃止痛的功效。臨床上主要用于氣滯血瘀引起的胃脘痛，以及慢性胃炎見有上述癥狀者?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2020年版一部?jī)H有對(duì)鹽酸小檗堿的含量測(cè)定，以及延胡索、大黃、黃連、吳茱萸、蓽澄茄的薄層色譜定性鑒別。中藥吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)。具有散寒止痛、降逆止嘔和助陽止瀉的功效［1］，吳茱萸作為臣藥在制劑中發(fā)揮溫中止痛、疏肝下氣的功效，目前關(guān)于吳茱萸質(zhì)量控制方面的研究多集中在吲哚喹啉類生物堿（如吳茱萸堿和吳茱萸次堿）的含量測(cè)定［2］，吳茱萸堿和吳茱萸次堿作為吳茱萸的主要活性成分，其含量將直接影響該制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)通過高效液相色譜法測(cè)定制劑中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，可以更加有效地控制蓽鈴胃痛顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters Acquity Arc高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器（美國(guó)沃特世科技有限公司）；METTLER TOLEDO XA105DU電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Elmasonic P300H超聲波清洗機(jī)（德國(guó)艾爾瑪公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥 吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)110802-201710，供含量測(cè)定用，含量以99.6%計(jì)）及吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)110801-201608，供含量測(cè)定用，含量以99.7%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇（美國(guó)霍尼韋爾公司，色譜純）、乙腈（美國(guó)霍尼韋爾公司，色譜純）、無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）、磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純），水為超純水。蓽鈴胃痛顆粒來自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司，批號(hào)分別為20092824、20092622、19121421。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（38∶62），柱溫：30℃，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：吳茱萸堿226 nm，吳茱萸次堿342 nm，進(jìn)樣量為20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取吳茱萸堿對(duì)照品16.80 mg，置于100 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.167 3 mg/ml的儲(chǔ)備液；精密稱取吳茱萸次堿對(duì)照品11.52 mg，置于100 ml量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.114 9 mg/ml的儲(chǔ)備液。分別精密吸取吳茱萸堿和吳茱萸次堿儲(chǔ)備液10 ml，置于同一50 ml量瓶中，加70%乙醇稀釋并定容至刻度，制成含吳茱萸堿33.48 μg/ml和吳茱萸次堿22.97 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（380 W，37 KHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照蓽鈴胃痛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］項(xiàng)下處方制備不含吳茱萸藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，吳茱萸堿與吳茱萸次堿色譜峰峰形對(duì)稱，色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于10 000，陰性樣品溶液在與供試品溶液中吳茱萸堿和吳茱萸次堿相同保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。見圖1。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16和20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定2個(gè)成分的色譜峰峰面積，結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿色譜峰面積RSD（n=6）分別為0.82%和0.73%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品（批號(hào)20092824）溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16和24 h進(jìn)樣測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積，RSD（n=6）分別為0.40%和0.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次供試品（批號(hào)20092824）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄吳茱萸堿和吳茱萸次堿的色譜峰面積，采用外標(biāo)法分別計(jì)算2種成分的含量，結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的RSD（n=6）分別為0.92%和1.03%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知2個(gè)成分含量（分別含吳茱萸堿66.41 μg/g、吳茱萸次堿49.97 μg/g）的樣品（批號(hào)20092824）6份，每份2.5 g，精密稱定，分別加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均回收率分別為96.39%和95.83%，RSD分別為1.10%和1.33%。見表2和表3。

表3 吳茱萸次堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品的測(cè)定 取3批樣品進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=6） μg/g

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 結(jié)合文獻(xiàn)，分別選用甲醇-水、乙腈-水［3-4］、乙腈-0.02%磷酸溶液［1］、乙腈-0.1%磷酸溶液［2］、乙腈-0.2%磷酸溶液［5］作為流動(dòng)相，當(dāng)選用甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)，吳茱萸堿與吳茱萸次堿色譜峰出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，且分離度不太理想，當(dāng)改用乙腈-磷酸溶液時(shí)，吳茱萸堿與吳茱萸次堿的峰形有所改善，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%磷酸（38∶62）時(shí)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿色譜峰分離效果較好，能夠和其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，色譜峰對(duì)稱性好且出峰時(shí)間適中，故選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.2 提取溶劑的選擇 吳茱萸堿和吳茱萸次堿幾乎不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，結(jié)合文獻(xiàn)，本試驗(yàn)分別選用甲醇［4，6］、無水乙醇［3，7-8］、80%乙醇［5，9-10］、70%乙醇［1-2，11］作為提取溶劑，當(dāng)采用甲醇、無水乙醇為溶劑進(jìn)行提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)也隨之提取出來，干擾目標(biāo)峰的分離，當(dāng)選用80%乙醇和70%乙醇作為提取溶劑時(shí)，可以有效規(guī)避雜質(zhì)峰的干擾，并且發(fā)現(xiàn)70%乙醇的提取效率稍優(yōu)于80%乙醇，結(jié)合前人試驗(yàn)研究［11］，采用超聲提取法可以使提取時(shí)間大大縮短，具有更高的提取效率和試驗(yàn)便捷性，故采用超聲提取法，以70%乙醇為提取溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 結(jié)合文獻(xiàn)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的檢測(cè)波長(zhǎng)多設(shè)置為215［1］、225［4-6，8-10］、250［3］和326 nm［2］，本試驗(yàn)在190~400 nm波長(zhǎng)下對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿的最大吸收波長(zhǎng)為226 nm，在230 nm之后吸收呈陡降趨勢(shì)，在300 nm之后幾乎無吸收響應(yīng)，吳茱萸次堿的最大吸收波長(zhǎng)為342 nm，在215 nm有較大吸收，在220 nm之后呈下降趨勢(shì)，在330~350 nm為強(qiáng)吸收區(qū)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分別在226 nm（吳茱萸堿）和342 nm（吳茱萸次堿）波長(zhǎng)下，吳茱萸堿和吳茱萸次堿響應(yīng)值均較高，且無雜質(zhì)峰干擾，故采用雙波長(zhǎng)法分別對(duì)吳茱萸堿和吳茱萸次堿進(jìn)行檢測(cè)。

通過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，表明該含量測(cè)定方法的專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，可以為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。