郝艷云，俞思慧，陸 靜，顧 湘，張 帆，程金科#，王田實#

1.上海交通大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子細胞生物學系，上海 200025；2.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201620；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心物質(zhì)成癮科，上海 200030；4.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海 200011；5.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200092

由致癌基因突變導致的細胞代謝重編程是引起腫瘤發(fā)生的主要原因［1］。越來越多的研究［2-3］表明，腫瘤細胞的代謝具有很高的可變性和靈活性。而線粒體作為能量代謝和氧化還原的主要場所，肩負著為腫瘤細胞的各種生理活動提供能源（ATP）和維持腫瘤細胞內(nèi)氧化-還原（redox）平衡的艱巨任務，這些過程對于腫瘤細胞的存活、生長和增殖至關重要［4-5］。組學分析也證實了線粒體蛋白的乙?；揎椗c腫瘤代謝之間確實存在著相互影響［6］。

沉默調(diào)節(jié)蛋白3（sirtuin 3，SIRT3）是依賴于NAD+的去乙?；?，主要存在于線粒體基質(zhì)中，是調(diào)控線粒體中能量代謝的關鍵因子［7］。越來越多的研究表明SIRT3能夠?qū)υS多參與線粒體氧化途徑的酶去乙酰化，促進營養(yǎng)物質(zhì)氧化以及能量生成［8］。SIRT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著重要角色［9-12］。報道［13］證實SIRT3 能夠調(diào)節(jié)線粒體活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，抑制腫瘤細胞存活和增殖。近期研究［14］也發(fā)現(xiàn)，SIRT3 的缺失能通過減少三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA 循環(huán)）和乙酰輔酶A 庫中谷氨酰胺的量來誘導彌漫大B細胞淋巴瘤的細胞死亡。

類泛素蛋白（small ubiquitin-like modifier protein，SUMO）也是參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子。它能夠通過SUMO 特異性激活酶（E1）、結(jié)合酶（E2）和連接酶（E3）催化與靶蛋白中的賴氨酸殘基偶聯(lián)，實現(xiàn)靶蛋白的SUMO 化修飾（SUMOylation）。蛋白質(zhì)的SUMO化修飾是一種可逆反應，受SUMO 特異性蛋白酶家族（sentrin-specific proteases，SENPs） 調(diào)控［15-16］。蛋白質(zhì)SUMO 化修飾會影響蛋白的細胞定位、活性以及穩(wěn)定性等。經(jīng)過20 多年的研究，蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾已經(jīng)被報道廣泛參與調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)的生物化學反應。因此，蛋白質(zhì)的SUMO 化修飾位點可能成為治療腫瘤的藥物靶點［17］。研究［16，18］證實，人的SIRT3蛋白能夠發(fā)生SUMO化修飾；在營養(yǎng)應激的條件下，SIRT3 的SUMO 化修飾減少，可增強SIRT3 的活性，降低其底物的乙?；剑纳凭€粒體的應激響應能力。人的SIRT3 SUMO 化修飾位點是第288 位賴氨酸殘基，當這一位點突變?yōu)榫彼幔↘288R）時，SIRT3 將不發(fā)生SUMO 化修飾，可增強線粒體氧化磷酸化和脂肪酸代謝，改善線粒體乃至細胞的活性［16，18-19］。由此，我們推測SIRT3 的SUMO 化修飾也能夠影響腫瘤細胞的代謝增殖以及對化學治療（化療）藥物的敏感性。

乳腺癌的發(fā)病率近幾十年來一直呈上升的趨勢［20］，應用抗癌藥物遏制腫瘤細胞已經(jīng)成為癌癥治療的重要手段之一［21］。阿霉素（adriamycin，ADM）是臨床上常用的廣譜抗腫瘤抗生素，它已經(jīng)被用于急性淋巴細胞白血?。?2］、淋巴瘤［23］、卡波西肉瘤［24］、乳腺癌［25］等癌癥的治療。但腫瘤治療過程中產(chǎn)生的耐藥性問題一直是腫瘤治療的大難題，目前的腫瘤化療往往因為化療敏感性低而失敗?；谝延袌蟮?，我們認為SIRT3 SUMO 化修飾通過調(diào)控其廣泛底物的乙?；剑绊懠毎麅?nèi)ROS 水平和能量代謝水平，可能影響腫瘤細胞的耐藥性。因此，本研究通過構(gòu)建SIRT3 SUMO 化位點突變的人乳腺癌細胞MCF7，來探討SIRT3的去SUMO 化修飾對腫瘤增殖及耐藥性的影響，以期發(fā)現(xiàn)提高腫瘤化療敏感性的新機制，為腫瘤的臨床治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（美國Gibco，10099141C），DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco，11995065），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Gibco，A1049101），B27 細胞培養(yǎng)添加劑（美國Gibco，17504044），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（美國Gibco，PHG0311L），MEGM 培養(yǎng)基（美國Lonza，CC-3150），青霉素-鏈霉素雙抗（美國Hyclone，SV30010）， Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen，L3000015），限制性內(nèi)切酶BbsⅠ（美國New England BioLabs，#R0539），T4 DNA 連接酶（美國New England BioLabs，#M0202），T4 多聚核苷酸激酶（美國New England BioLabs，#M0236），E. coli感受態(tài)細胞（中國TIANGEN， CB101）， pX330 質(zhì)粒（美國Addgene，#127875），Gag-pol 質(zhì)粒（美國Addgene，#14887），pVSV-G 質(zhì)粒（美國Addgene，#138479），抗SIRT3 抗體（美國CST，#5490），抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國CST，#4967），兔源二抗（美國CST，#7074P2），蛋白A瓊脂糖純化樹脂（中國YEASEN，36401ES25），阿霉素（美國Sigma，D1515）。pBABE-3×Flag 質(zhì)粒來源于本實驗室?guī)齑妫?8］，抗SUMO1抗體由本實驗室自行制備［26］。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 本研究主要使用的細胞系為人乳腺癌細胞（MCF7：美國ATCC，HTB-22），購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。經(jīng)鑒定，該細胞系無支原體污染。該細胞為貼壁細胞，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中，每周傳代2～3 次。本研究的所有實驗均經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.2.2 構(gòu)建用于敲除SIRT3基因的pX330-sgRNA 質(zhì)粒 利用美國麻省理工學院的CRISPR sgRNA 設計在線平臺（http：//crispr.mit.edu）設計sgRNA 的引物序列。在美國國立生物技術信息中心（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）查找人SIRT3基因的編碼序列，同時確定基因敲除位點。表1是最終合成的3對sgRNA引物。

表1 sgRNA引物信息Tab 1 Primers used for sgRNA

首先，用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ對pX330 質(zhì)粒在37 ℃下酶切30 min。同時，將合成的sgRNA 用T4 多聚核苷酸激酶在37 ℃孵育30 min，隨后在95 ℃作用5 min，每分鐘降低5 ℃直到25 ℃，完成磷酸化過程。然后，將磷酸化的sgRNA 與瓊脂糖凝膠回收的BbsⅠ酶切質(zhì)粒通過T4 DNA 連接酶連接。最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細胞，挑取單克隆測序鑒定pX330-sgRNA 質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 構(gòu)建MCF7-SIRT3KO 細胞系 通過脂質(zhì)體Lipo3000 將pX330-sgRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進MCF7細胞。首先，將轉(zhuǎn)染pX330-sgRNA 的MCF7 細胞培養(yǎng)24～48 h 并計數(shù)，然后將細胞均勻移種到96 孔板中，加入DMEM 完全培養(yǎng)基開始單克隆培養(yǎng)，通過24 孔板、6 孔板持續(xù)傳代培養(yǎng)1個月左右得到1×105個以上的細胞，然后一半用于鑒定，另一半移種到24 孔板繼續(xù)培養(yǎng)。用于鑒定的細胞系經(jīng)RIPA溶液［含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、0.3%NP40 和1%蛋白酶抑制劑］裂解變性，通過SDS-PAGE 和SIRT3 抗體檢測確定SIRT3KO 細胞株構(gòu)建成功。

1.2.4 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒 通過設計帶有酶切位點的基因序列引物，將相應的人的SIRT3基因序列插入到pBABE-3×Flag 的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點之間，構(gòu)建SIRT3 WT反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，具體引物序列見表2。

在SIRT3 WT 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中，通過設計SIRT3 第288位賴氨酸編碼基因周圍的引物序列將該位點突變?yōu)榫彼?，使相應質(zhì)粒表達的SIRT3 蛋白不能夠發(fā)生SUMO化修飾，且結(jié)構(gòu)電荷不發(fā)生過多改變，從而構(gòu)建SIRT3 K288R反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，相應引物序列見表2。

表2 構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒引物序列Tab 2 Primers used for retroviral plasmids construction

1.2.5 反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒感染MCF7SIRT3KO細胞系 反轉(zhuǎn)錄病毒感染前24 h，在10 cm培養(yǎng)皿中接種MCF7細胞，待細胞貼壁生長匯合至60%～70%。通過反轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒Gag-pol、pVSV-G和目標基因質(zhì)粒在293T細胞系產(chǎn)生病毒液。用3 mL病毒液、1 mL培養(yǎng)基和8μg/mL的聚凝胺感染MCF7SIRT3KO 細胞系，通過嘌呤霉素篩選構(gòu)建空載（Vector）、SIRT3 WT和SIRT3 K288R細胞系。

1.2.6 細胞線粒體組分分離 收集1×108個細胞，用PBS洗滌細胞2遍，用冰浴預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，取少量細胞用于計數(shù)，剩余細胞在4 ℃下600×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 線粒體分離液［210 mmol/L 甘露醇、70 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）、1 mmol/L EGTA、0.5 mg/mL BSA］至細胞或組織中，輕輕吹打細胞，冰上放置10～15 min；把細胞懸液轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，勻漿30下左右。細胞勻漿液在4 ℃下600×g離心10 min，沉淀主要為細胞核組分，小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，在4 ℃下3 500×g離心10 min，小心去除上清組分，沉淀即為分離得到的細胞線粒體。

1.2.7 免疫沉淀實驗 收集1×108個細胞的線粒體組分，用PBS 沖洗1～2 遍，加入300 μL 細胞裂解緩沖液［含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、300 mmol/L NaCl、0.3%NP40 和1%蛋白酶抑制劑］，13 500×g離心后取上清液。取1/10 裂解液作為陽性對照樣本，剩余裂解液加入1 μL相應的抗體，在4 ℃下?lián)u床孵育過夜。將10 μL 蛋白A瓊脂糖純化樹脂加入上述細胞裂解液并在4 ℃下?lián)u床孵育2～3 h。在4 ℃下4 500×g離心5 min，將瓊脂糖純化樹脂離心至管底；將上清液小心吸去，再將瓊脂糖純化樹脂用裂解緩沖液洗3次。最后，進行Western blotting分析。

1.2.8 阿霉素耐藥性實驗 以1×105個/孔的密度將MCF7細胞接種到96孔板中，加入含有10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在各孔中分別加入終濃度為10、5、2.5、1.25 μg/mL阿霉素處理24、48、72 h，以未加阿霉素處理的細胞作為對照組，用分光光度儀讀取波長540 nm 處的吸光度值［D（540 nm）］，通過公式［細胞活性=（D樣本/D對照）×100%］計算細胞活性，確定SIRT3 K288R 乳腺癌細胞在體外對于化療藥物的敏感性。分別計算阿霉素在3個細胞株的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，所有實驗至少重復3次，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建立SIRT3 SUMO化修飾位點突變的MCF7細胞系

為了特異性地研究SIRT3 蛋白對乳腺癌細胞的影響，我們首先構(gòu)建了將SIRT3敲除的MCF7細胞系。將構(gòu)建好的pX330-sgRNA 轉(zhuǎn)染至MCF7 細胞，用Western blotting檢測SIRT3 蛋白條帶，驗證轉(zhuǎn)染效率，并篩選陰性克隆，用未轉(zhuǎn)染的MCF7 細胞作陽性對照。結(jié)果（圖1A）可見sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3轉(zhuǎn)染后均無SIRT3條帶，說明SIRT3 無表達；故sgRNA1、sgRNA2 和sgRNA3 均成功構(gòu)建出了SIRT3敲除的MCF7 細胞系，即MCF7-SIRT3KO細胞，可用于單克隆細胞培養(yǎng)。

為了進一步研究SIRT3 的SUMO 化對乳腺癌的影響，我們在MCF7-SIRT3KO 細胞的基礎上，分別轉(zhuǎn)入SIRT3 WT 質(zhì)粒和SIRT3 K288R 質(zhì)粒。得到SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，以感染空病毒載體的MCF7-SIRT3KO 細胞作為對照（Vector 組）。然后，用免疫共沉淀和Western blotting 鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系（圖1B），在Input中，SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 可見相對分子質(zhì)量28 000的蛋白條帶，而Vector組無條帶，表明2株細胞系均成功轉(zhuǎn)入SIRT3 質(zhì)粒。用SIRT3 抗體做免疫沉淀，并用SIRT3和SUMO1 抗體檢測，結(jié)果顯示SIRT3 WT 有SUMO 化修飾，即存在一個相對分子質(zhì)量為47 000 的條帶，而在SIRT3 K288R則沒有，表明SIRT3 K288R能夠使MCF7細胞的SIRT3 SUMO 化修飾缺失，可用于研究SIRT3 去SUMO化修飾在乳腺癌細胞的作用。

圖1 通過免疫沉淀和Western blotting鑒定構(gòu)建的SIRT3 SUMO位點突變細胞系Fig 1Confirmation of SIRT3 SUMOylation deficiency cell line by immunoprecipitation and Western blotting

2.2 SIRT3去SUMO化修飾對乳腺癌細胞增殖的影響

乳腺癌細胞的增殖對乳腺癌的惡化、轉(zhuǎn)移及治療耐藥性均有明顯的促進作用，控制癌細胞的增殖已經(jīng)成為遏制腫瘤對機體進一步侵襲的有效手段。SIRT3的SUMO化修飾能減弱SIRT3 的活性，進而降低蛋白質(zhì)的去乙?；剑?8］，但SIRT3 的SUMO 化修飾是否影響乳腺癌細胞的增殖并不清楚。我們使用超低吸附6 孔板將Vector、SIRT3 WT和SIRT3 K288R細胞株培養(yǎng)于無血清的MEGM培養(yǎng)基中，連續(xù)7 d 每隔24 h 對細胞進行計數(shù)，測定細胞的生長曲線，以檢測SIRT3 去SUMO 化修飾對乳腺癌細胞增殖速率的影響。結(jié)果（圖2A）顯示，相同培養(yǎng)時間下，SIRT3 K288R 細胞株的增殖速率明顯低于SIRT3 WT和Vector 細胞系，表明SIRT3 不能發(fā)生SUMO 化修飾時，即SIRT3活性增強時對乳腺癌細胞的增殖速率有抑制作用。

同時，我們使用超低吸附6 孔板將Vector、SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 細胞株培養(yǎng)于無血清的MEGM 培養(yǎng)基中（添加B27和EGF）10 d。培養(yǎng)過程中在顯微鏡下對非黏附性乳腺球群細胞測量直徑大??；發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R細胞株直徑最小（圖2B），表明其增殖最緩慢。綜上，我們的研究表明SIRT3 的去SUMO 化修飾對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用。

圖2 3組細胞的7 d生長曲線和非黏附性乳腺球群細胞Fig 2 Seven-day growth curves of cells and non-adherent breast cancer cell clumps in 3 groups

2.3 SIRT3去SUMO化修飾對腫瘤細胞耐藥性的影響

癌細胞的耐藥性增強使得癌細胞能有效逃脫臨床藥物的治療，這使得腫瘤治療面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。阿霉素是一類廣譜抗腫瘤藥物，用于乳腺癌等腫瘤的治療。為了進一步研究SIRT3 去SUMO 化修飾對腫瘤耐藥性的影響，我們對Vector、SIRT3 WT 和SIRT3 K288R 細胞系進行了阿霉素耐藥性實驗。通過分析3株細胞系在化療藥物處理下的活性差異，我們發(fā)現(xiàn)在細胞培養(yǎng)24、48 和72 h時，阿霉素濃度為2.5、5 和10 μg/mL 的條件下，SIRT3 K288R 細胞株的活性均顯著高于SIRT3 WT 和Vector 細胞系，表明SIRT3 SUMO 位點突變后，乳腺癌細胞的耐藥性增強。同時，隨著阿霉素濃度的增加，SIRT3 K288R細胞株的活性由低于SIRT3 WT 逐漸轉(zhuǎn)變成高于SIRT3 WT，我們在細胞培養(yǎng)24、48和72 h時均觀察到了這種現(xiàn)象（圖3），進一步提示SIRT3 SUMO 化能提高乳腺癌細胞在體外對于化療藥物的敏感性。

圖3 3種細胞株經(jīng)不同濃度阿霉素處理24 h（A）、48 h（B）和72 h（C）后的活性比較Fig 3 Cell viability of 3 cell lines treated with various concentrations of ADM for 24 h(A),48 h(B),and 72 h(C)

計算阿霉素的IC50，其值越高，說明細胞對阿霉素的耐藥性越強。阿霉素不同時間處理下Vector、SIRT3 WT和SIRT3 K288R 細胞系的IC50見表4，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R 的IC50在3 個時間點均高于Vector 和SIRT3 WT，表明SIRT3 SUMO 化修飾位點突變的MCF7 細胞對阿霉素的耐藥性最強，即SIRT3 去SUMO 化修飾使乳腺癌細胞系的耐藥性增強。

表3 阿霉素處理3種細胞不同時間的IC5（0μg·mL-1）Tab 3 IC50 of ADM in 3 cell lines for different time（μg·mL-1）

3 討論

根據(jù)Warburg效應，即使在有氧的情況下，腫瘤細胞仍然優(yōu)先地利用葡萄糖進行糖酵解從而獲取能量［27］。脂肪酸合成及氧化代謝活躍是惡性腫瘤普遍具有的特異性之一［28］。而去乙?；窼IRT3 促進氧化磷酸化和脂肪酸氧化的代謝，從而能夠降低糖酵解水平，起到抑制腫瘤增殖的作用。SIRT3 的SUMO 化修飾能夠抑制其活性，去SUMO 化修飾可增強其活性，因此SIRT3 去SUMO 化修飾后具有抑制腫瘤細胞增殖的潛質(zhì)。

SUMO 化修飾在乳腺癌中扮演著重要的角色，它可以控制乳腺癌細胞類型的轉(zhuǎn)變［29］，還能調(diào)控細胞有絲分裂中紡錘體的功能進而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程［30］。也有報道，SUMO 化修飾的乳腺癌1 號基因編碼蛋白（breast cancer suppressor protein，BRCA1）調(diào)控DNA 損傷反應，而BRCA1的突變與高風險的乳腺癌有極大的相關性［31］。對癌癥中SUMO 化修飾作用的研究將成為癌癥治療的新方向。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌患者的ROS 明顯高于ER 陰性患者，并且在ER陽性患者中，ROS 與腫瘤大小和組織轉(zhuǎn)移相關［32］，因此我們選擇ER 陽性的MCF7 細胞系作為研究對象，探索SIRT3 去SUMO 化修飾對乳腺癌細胞增殖和耐藥性的影響。為了研究SIRT3 去SUMO 化修飾對乳腺癌的影響，我們在SIRT3KO MCF7 細胞的基礎上，構(gòu)建了SIRT3 WT和SIRT3 K288R 的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。我們發(fā)現(xiàn)在SIRT3 的SUMO 化修飾位點突變的乳腺癌細胞增殖受到了抑制，這與已報道的SIRT3 SUMO 化修飾位點突變增強氧化磷酸化和脂肪酸氧化代謝，糖酵解受抑是能夠相互印證的。

在正常細胞中，SIRT3維持線粒體代謝、增強抗氧化系統(tǒng)，保護細胞免受自身凋亡。而在腫瘤細胞中，SIRT3能通過產(chǎn)生較低水平的ROS，減少細胞凋亡和自噬，提高細胞活性，從而能夠抵抗化療誘導的氧化應激，使其獲得較高的細胞存活率。有研究表明，通過特異siRNA沉默SIRT3在MCF7 和T47D 細胞系中的表達，能夠增加化療藥物誘導的氧化應激，從而提高乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性，患者的生存曲線也顯示高SIRT3 表達的乳腺癌預后較差［11］。通過對SIRT3 WT 和SIRT3 K288R細胞株給予不同濃度的阿霉素，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3 K288R細胞株均比SIRT3 WT 細胞株耐藥，而隨著阿霉素處理濃度的逐漸增加，SIRT3 WT 的活性由明顯高于SIRT3 K288R轉(zhuǎn)變成明顯低于SIRT3 K288R，表明SIRT3 K288R的耐藥性高于SIRT3 WT。SIRT3 SUMO 化位點突變性細胞系與野生型對比，在使用不同濃度的阿霉素處理不同的時間后，SIRT3 K288R 的IC50在3 個時間點（24 h、48 h 和72 h）均高于Vector 和SIRT3 WT，進一步證明SIRT3 的去SUMO 化修飾能夠顯著增強腫瘤細胞對阿霉素的耐藥性。這些結(jié)果都表明，SIRT3 的SUMO 化修飾能夠改變腫瘤細胞的生長和代謝狀態(tài)。該結(jié)論可為治療乳腺癌的潛在靶點提供更多的理論方向。