張偉，朱賢林，吳幫林，朱榮譽，潘琴，梅榮

七氟烷是臨床麻醉中應(yīng)用較廣的吸入性麻醉劑，但可損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而影響患者學(xué)習(xí)、記憶、神經(jīng)發(fā)育，七氟烷吸入過量，會對海馬神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致其大量凋亡[1-2]。大腦海馬區(qū)屬于一種復(fù)雜的大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一旦海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生損傷，會導(dǎo)致記憶功能、學(xué)習(xí)能力下降，出現(xiàn)認(rèn)知障礙[3]?；罨字＜〈?3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)在細(xì)胞中參與程序性細(xì)胞死亡過程，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)屬于其下游分子，依靠PI3K調(diào)節(jié)，對多種轉(zhuǎn)錄因子有調(diào)控作用，抑制凋亡基因表達(dá)[4]。林晨等[5]研究指出，PI3K/Akt通路激活對創(chuàng)傷性腦損傷神經(jīng)保護(hù)作用顯著。丙泊酚屬于一種靜脈麻醉藥物，能減輕七氟烷產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，對心腦血管有一定的保護(hù)作用[6]，但目前其具體的作用機制尚不明確。本研究基于PI3K/Akt通路探究丙泊酚對七氟烷誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康、清潔級Wistar雄性大鼠30只，日齡3周，體質(zhì)量220～260 g，均由華北制藥股份有限公司提供，SYXK(冀)2019-011。大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50%左右，黑/白光照12 h交替。(2)試藥試劑：戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛及其試劑盒(碧云天生物科技有限公司),乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、bcl-2相關(guān)的X基因(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-過氧化氫酶(GSH-Px)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)及其試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；(3 )儀器設(shè)備：圓形水迷宮(北京廣精儀儀器設(shè)備有限公司，型號XR-XM101)，顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司，型號XYH-3B)，溫箱(上?；巯膬x器設(shè)備有限公司，型號 WHTH-150)，酶標(biāo)儀(無錫集佳智能科技有限公司，型號 VarioskanLUX)，紅外熒光成像系統(tǒng)(上海易匯生物科技有限公司，型號 FOTRIC)。

1.2 實驗方法 2020年1月—2021年1月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院實驗室進(jìn)行實驗。30只Wistar雄性大鼠隨機數(shù)字表法分為對照組、七氟烷組、七氟烷+丙泊酚組(聯(lián)合組)，各10只。七氟烷組吸入1.5%七氟烷，1 h/d；聯(lián)合組在七氟烷組基礎(chǔ)上加丙泊酚150 mg/kg腹腔注射；對照組給予等體積的生理鹽水干預(yù)。3組均連續(xù)干預(yù)2周。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 Morris水迷宮實驗：干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠行Morris水迷宮實驗，將圓形水迷宮分為4個象限，選擇任意一個象限，在其水面下置隱蔽平臺，大鼠隨機放入水中，大鼠尋找平臺時間即為逃避潛伏期(4個象限入水點各訓(xùn)練1次/d，每次間隔20 min)，統(tǒng)計大鼠第5 天逃避潛伏期。第6 天進(jìn)行空間探索實驗，平臺撤去，隨機選擇1個象限放入大鼠，統(tǒng)計大鼠60 s內(nèi)穿越平臺位置次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間占比。

1.3.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡觀察：采用戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠后，開胸取出神經(jīng)組織，采用生理鹽水沖洗后，在4%多聚甲醛中固定；分離海馬組織，于4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，制作切片(3 μm)，嚴(yán)格按照TUNE試劑盒說明書操作，顯微鏡下隨機選擇5個視野，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)量，棕黃色細(xì)胞顆粒為陽性，陽性細(xì)胞率即為海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)、凋亡相關(guān)因子水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測。提取腦組織勻漿包被液適當(dāng)稀釋，加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中，加蓋 4℃保存 24 h。次日使用洗滌液進(jìn)行3次全方位洗滌，甩干；各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢標(biāo)本0.1 ml，同時增加陽性和陰性對照，置于43℃溫箱60 min，移去液體；同前洗滌3次，甩干；各孔內(nèi)加稀釋LDH、MDA、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、Bcl-2各 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前洗滌3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min；各孔內(nèi)加2 mol/L的LDH、MDA、SOD、GSH-Px、Bax、Caspase-3、Bcl-2各0.05 ml，終止反應(yīng)。試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，實驗操作步驟嚴(yán)格根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.3.4 PI3K/Akt通路蛋白檢測：采用免疫印跡(Western blot，WB)將PI3K、p-Akt(大鼠神經(jīng)組織)標(biāo)本提取液，離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復(fù)凍融后，再離心處理，提取上清液，采用酶標(biāo)儀檢測PI3K、p-Akt蛋白濃度，保存。PI3K、p-Akt樣本滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加 Marker、變性蛋白樣品5 μl，電泳干預(yù)30 min，待蛋白分離膠底，結(jié)束電泳；轉(zhuǎn)膜成功后將硝酸纖維素膜(NC)在5%脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗(PI3K、p-Akt 1∶1 000)孵育，經(jīng)過震蕩洗膜后加二抗(PI3K、p-Akt 1∶10 000)，孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對結(jié)果給予分析。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗比較 逃避潛伏期比較，七氟烷組>聯(lián)合組>對照組(P<0.01)；穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間占比比較，七氟烷組<聯(lián)合組<對照組(P<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠Morris水迷宮實驗比較

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較，七氟烷組(39.50%±4.15%)>聯(lián)合組(20.55%±3.50%)>對照組(5.10%±1.55%)(F=36.834，P=0.001)；聯(lián)合組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率低于七氟烷組(t=11.040，P=0.001)，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較(TUNEL染色，×200)

2.3 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 LDH、MDA水平比較，七氟烷組>聯(lián)合組>對照組(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平比較，七氟烷組<聯(lián)合組<對照組(P<0.01)，見表2。

表2 3組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

2.4 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)因子水平比較 Bax、Caspase-3水平比較，七氟烷組>聯(lián)合組>對照組(P<0.01)；Bcl-2水平比較，七氟烷組<聯(lián)合組<對照組(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織凋亡相關(guān)因子水平比較

2.5 各組大鼠PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)比較 PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較，七氟烷組<聯(lián)合組<對照組(P<0.05)，見表4、圖2。

圖2 各組大鼠PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)比較

表4 各組大鼠PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)比較

3 討 論

相關(guān)研究顯示，吸入麻醉會導(dǎo)致神經(jīng)毒性產(chǎn)生，可能與老年認(rèn)知功能的衰退相關(guān)，但作用機制仍不確定[7]。吸入七氟烷會引起記憶損傷，主要是因為吸入七氟烷會影響海馬區(qū)CA1區(qū)椎體神經(jīng)元電壓門控通道，在大腦發(fā)育過程中，抑制神經(jīng)元電壓門控通道，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8-9]。目前七氟烷產(chǎn)生的認(rèn)知障礙是麻醉醫(yī)學(xué)研究的重中之重。丙泊酚作用特點是起效快、消除迅速，能提高中樞抑制性神經(jīng)傳遞，從而抑制中樞興奮性，這一功能特殊，與其他類型麻醉鎮(zhèn)靜藥物比較，其在臨床應(yīng)用中潛能更大[10]。

本結(jié)果顯示，丙泊酚能增加大鼠逃避潛伏期，減少穿越平臺次數(shù)，縮短目標(biāo)象限停留時間，從而改善大鼠記憶、認(rèn)知能力。肖秀英等[11]研究也指出，丙泊酚+七氟烷能降低大鼠逃離時間，減少錯誤反應(yīng)次數(shù)和Longa評分，從而有效改善大鼠神經(jīng)功能和記憶能力，與本研究結(jié)果保持一致。海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能損傷的主要原因[12]。本研究中丙泊酚能降低海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，從而抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步改善大鼠神經(jīng)功能。

SOD作為一種抗氧化酶，具有清除自由基的作用，可以協(xié)同GSH-Px將自由基產(chǎn)生的過氧化物分解酶清除，避免氧化應(yīng)激損傷[13]。MDA屬于脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，具有一定的細(xì)胞毒性，LDH是一種糖原溶解酶，反映細(xì)胞膜損傷程度[14]。研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加會導(dǎo)致神經(jīng)元受損，SOD、GSH-Px作為內(nèi)源性抗氧化酶在抗氧化防御機制中起著重要作用[15-16]。本研究中丙泊酚通過使LDH、MDA水平下降，SOD、GSH-Px水平升高，改善七氟烷誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激起到神經(jīng)保護(hù)作用。Bax是線粒體膜主要的成分之一，Bcl-2在線粒體膜外廣泛分布，對線粒體膜通透性有一定的調(diào)節(jié)能力，在細(xì)胞凋亡中至關(guān)重要[17]。Caspase-3主要是通過Caspase-9自身裂解產(chǎn)生，參與細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。本研究中丙泊酚通過下調(diào)Bax、Caspase-3水平，上調(diào)Bcl-2水平從而抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能。

PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞中具有雙重作用，一方面能抑制Bcl-2相關(guān)死亡促進(jìn)因子，對細(xì)胞增殖有誘導(dǎo)作用，另一方面將下游抗凋亡蛋白激活，起到抗凋亡作用[19-20]。已有研究證實，大鼠在七氟烷吸入前給予一定的LY294002和依達(dá)拉奉干預(yù)，LY294002會逆轉(zhuǎn)依達(dá)拉奉對海馬區(qū)神經(jīng)元保護(hù)作用，將PI3K/Akt信號通路激活抑制海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡[21]。本結(jié)果顯示，丙泊酚通過上調(diào)PI3K、p-Akt表達(dá)，將PI3K/Akt信號通路激活，下游Bax、Caspase-3蛋白下調(diào)，Bcl-2蛋白上調(diào)抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，丙泊酚能改善七氟烷誘導(dǎo)大鼠認(rèn)知功能損傷，通過調(diào)節(jié)LDH、MDA、SOD、GSH-Px水平改善大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活PI3K/Akt通路，調(diào)控下游Bax、Caspase-3、Bcl-2水平抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，為臨床研究丙泊酚作用機制提供數(shù)據(jù)支持。本研究的局限性未對丙泊酚使用劑量進(jìn)行分組研究，因此，需要后續(xù)研究丙泊酚使用的最佳劑量。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張偉、朱賢林：設(shè)計課題、研究方案，實施研究過程，論文撰寫；吳幫林、朱榮譽：提出研究思路，分析實驗數(shù)據(jù)，論文審核; 潘琴：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;梅榮：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析