趙利平，梁衛(wèi)章，張俊民，代寶春，姜紅，劉秀珍

過(guò)敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)也稱(chēng)免疫球蛋白A血管炎(IgAV)，是一種系統(tǒng)性血管炎，其特征是IgA免疫復(fù)合物沉積在皮膚和其他器官(如胃腸道、關(guān)節(jié)、腎)[1]。腎臟受累于IgAV，稱(chēng)為過(guò)敏性紫癜性腎炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN)，是最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是影響HSP患者長(zhǎng)期預(yù)后的主要因素[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，嬰兒中HSP的發(fā)生率是成人的2～33倍，超過(guò)90%的病例<10歲，約有40%的HSP兒童發(fā)生腎臟受累，甚至發(fā)展成晚期腎病[3]。迄今為止，HSPN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，通常認(rèn)為HSPN與異常的免疫功能有關(guān)。既往已有大量研究證實(shí)，輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)免疫失衡在HSPN發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，而Th17細(xì)胞特征的穩(wěn)定和維持主要通過(guò)白介素-23(IL-23)來(lái)實(shí)現(xiàn)[4]。不少研究發(fā)現(xiàn)在HSPN患兒血清中IL-23明顯高于健康兒童[5]。甘草酸銨具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、肝臟保護(hù)和抗癌活性，已在臨床上用于治療免疫介導(dǎo)的肝損傷，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞(Th1、Th2、Th17和Treg)的平衡，抑制肝細(xì)胞凋亡[6-8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，甘草為臨床上中藥復(fù)方治療過(guò)敏性紫癜的常用藥，對(duì)急性腎損傷也有一定的保護(hù)作用，但是甘草酸銨對(duì)HSPN的作用機(jī)制及腎功能的影響尚不清楚[9-10]。因此，現(xiàn)建立HSPN小鼠模型，探討甘草酸銨對(duì)HSPN腎功能的影響，為HSPN的治療和甘草酸銨臨床更好的應(yīng)用提供參考，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：雄性健康SPF級(jí)C57BL/6小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量(18～20)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，于溫度為(24±2)℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。動(dòng)物使用的所有實(shí)驗(yàn)程序均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南，并已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：L2020061902)。

1.1.2 藥物試劑：甘草酸銨(湖北西音和醫(yī)藥有限公司，原料藥，純度99.98%)，注射用環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)，小鼠尿蛋白檢測(cè)試劑盒(上海心語(yǔ)生物科技有限公司)，小鼠血清IL-23、IL-17、免疫球蛋白A(IgA)、循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗鼠IL-23抗體、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、羊抗兔二抗(英國(guó)Abcam公司)。

1.1.3 儀器設(shè)備：iMark680型多功能酶標(biāo)儀、FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)，WD-9413A型凝膠成像系統(tǒng)(撫州金時(shí)速儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年7月—2021年1月在邯鄲市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，80只小鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取12只作為空白對(duì)照組，其余小鼠參照文獻(xiàn)[11]方法采用BSA、LPS和CCl4建立HSPN模型：除空白對(duì)照組外，其余小鼠予BSA 4 ml/kg 灌胃，1次/2 d，持續(xù)8周；皮下注射CCl4(蓖麻油0.3 ml + CCl40.1 ml)，1次/周，持續(xù)9周；并在第6、8、10和12周時(shí)尾靜脈注入 LPS(0.025%)0.2 ml，建立IgA腎病模型；從第9周開(kāi)始，25%生姜水10 ml/kg灌服，1次/2 d；在建模期間將室溫調(diào)節(jié)至30℃，構(gòu)建血熱證模型，復(fù)合成為HSPN模型?？瞻讓?duì)照組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，等量生理鹽水尾靜脈注射和皮下注射。在第12周結(jié)束時(shí)隨機(jī)選取6只模型小鼠檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒ΑＤＰ统晒?biāo)準(zhǔn)：皮下出現(xiàn)紫癜，顯微鏡下可見(jiàn)局灶性上皮細(xì)胞增多和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟發(fā)生病理改變。在造模過(guò)程中小鼠死亡2只。

將造模成功的小鼠60只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、環(huán)磷酰胺組(22 mg/kg)[12]及甘草酸銨低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg)[13]，每組12只。環(huán)磷酰胺組、甘草酸銨各劑量組小鼠從第13周開(kāi)始，腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，1次/d；空白對(duì)照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，共給藥4周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 尿蛋白及尿紅細(xì)胞測(cè)定：給藥結(jié)束后，收集各組小鼠24 h尿液，采用尿蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定24 h尿蛋白水平，尿沉渣計(jì)數(shù)法測(cè)定尿液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 血清IL-23、IL-17、IgA、BUN、SCr、CIC水平測(cè)定：收集尿液完成后，首先使用毛細(xì)管在眼眶靜脈叢采集小鼠外周血0.2 ml備用，然后采用摘眼球取血的方法取血0.5 ml，將0.5 ml血液分離血清，ELISA法檢測(cè)血清中IL-23、IL-17、IgA、BUN、SCr、CIC水平。

1.3.3 小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17及Treg細(xì)胞比例測(cè)定：取1.3.2中采集的0.2 ml外周血，按照小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒操作制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液中Th17及Treg分別占CD4+T細(xì)胞的百分比，并計(jì)算各組Th17/Treg細(xì)胞比值。

1.3.4 腎臟組織形態(tài)學(xué)變化：采血完成后，取小鼠雙側(cè)腎臟組織，一側(cè)腎臟組織液氮速凍后-80℃保存待測(cè)。另一側(cè)腎臟組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切成5 μm切片進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織的形態(tài)變化。

1.3.5 小鼠腎臟組織IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)：取-80℃保存的腎臟組織，加入RIPA裂解液研磨后，于冰上靜置30 min充分裂解后離心，取上清液為總蛋白溶液，BCA法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)，聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗(IL-23、p-STAT3、STAT3 按1∶1 000比例進(jìn)行稀釋?zhuān)?actin按1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)于4℃下孵育過(guò)夜，加入羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠24 h尿蛋白及環(huán)磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較

2.2 各組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、SCr及環(huán)磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr降低(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清IL-23、IL-17、IgA、CIC、BUN、SCr水平比較

2.3 各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17、Treg及Th17/Treg細(xì)胞比值比較 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占比、Th17/Treg細(xì)胞比值顯著升高，Treg細(xì)胞占比顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，環(huán)磷酰胺組及甘草酸銨低、中、高劑量組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占比、Th17/Treg細(xì)胞比值顯著降低，Treg細(xì)胞占比顯著升高(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞占比、Th17/Treg細(xì)胞比值升高，Treg細(xì)胞占比降低(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17、Treg及Th17/Treg細(xì)胞比值比較

2.4 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化比較 HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)生明顯病變；模型組小鼠出現(xiàn)腎小球囊性滲出、出血，腎小球基底膜增生，間質(zhì)纖維化和腎小球硬化，也可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠腎臟組織上述病理癥狀未見(jiàn)明顯改善，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，環(huán)磷酰胺組和甘草酸銨中、高劑量組小鼠腎臟組織上述癥狀明顯減輕，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.5 各組小鼠腎臟組織IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，甘草酸銨低劑量組小鼠腎臟組織中IL-23蛋白及環(huán)磷酰胺組、甘草酸銨中、高劑量組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，甘草酸銨低、中劑量組腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，甘草酸銨高劑量組小鼠上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

表4 各組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)比較

注：G.腎小球；黑色箭頭代表有出血；圓圈代表腎小球基底膜增厚；星號(hào)代表炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

圖2 各組小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3、STAT3蛋白印跡圖

3 討 論

血尿和蛋白尿是HSPN患者腎臟受累的主要特征[14]。從無(wú)癥狀的微觀血尿到蛋白尿和各種程度的急性腎損傷，再到迅速進(jìn)行性腎小球腎炎，一些兒童最終發(fā)展為慢性腎病或終末期腎病，對(duì)家庭和社會(huì)都是沉重的負(fù)擔(dān)。因此，研究HSPN的發(fā)病機(jī)制并給予合理的治療具有重要意義。

HSPN與免疫功能介導(dǎo)的炎性反應(yīng)密切相關(guān)。既往已有研究證實(shí)，HSPN患兒外周血中Th17細(xì)胞的比例顯著增加，Th17細(xì)胞的異?；罨c患者體內(nèi)促炎因子的產(chǎn)生及血管炎的發(fā)展關(guān)系密切[15]。而IL-23是維持Th17細(xì)胞穩(wěn)定的重要因子，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-17產(chǎn)生和釋放，介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HSPN患兒血清中IL-23明顯高于健康兒童，且Treg細(xì)胞比例顯著降低[5]。本研究結(jié)果顯示，HSPN小鼠血清中IL-23、IL-17水平及外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比值顯著高于正常小鼠，與上述結(jié)果一致；同時(shí)24 h尿蛋白水平、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血清IgA、CIC、BUN、SCr水平均升高，提示體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞比例的失衡，可能打破了機(jī)體正常的免疫狀態(tài)，引發(fā)一系列的免疫和炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腎組織損傷；再次證實(shí)IL-23可能在HSPN的發(fā)病過(guò)程中起重要作用。甘草酸銨是臨床常用的治療免疫性肝損傷的藥物，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞Th17和Treg的平衡[17]。已有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方甘草酸銨對(duì)過(guò)敏性紫癜有保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，給予甘草酸銨治療后，小鼠血清IL-23、IL-17和免疫功能、腎功能指標(biāo)水平降低，外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17/Treg細(xì)胞比值降低，提示甘草酸銨可能通過(guò)調(diào)節(jié)HSPN小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡，減輕HSPN小鼠腎損傷。

STAT3是Th17和Treg細(xì)胞分化的決定因素，在協(xié)調(diào)Th17細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和致病性中起關(guān)鍵作用[19]。IL-23的功能主要通過(guò)STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-23的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞成熟分化，并刺激Treg細(xì)胞中的STAT3磷酸化，STAT3的過(guò)度磷酸化會(huì)通過(guò)下調(diào)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)和叉頭框蛋白3(Foxp3)的表達(dá)損害Treg細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌，而抑制STAT3的磷酸化則會(huì)恢復(fù)這些功能[20]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3基因多態(tài)性與過(guò)敏性紫癜易感性相關(guān)[21]；且STAT家族因子的表達(dá)，參與梗阻性腎病、糖尿病腎病、急性腎損傷等腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，抑制該信號(hào)通路有助于延緩疾病的進(jìn)展[22]。在系統(tǒng)性硬化病中，抑制STAT3信號(hào)通路，可抑制Th17細(xì)胞的增殖[23]；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，通過(guò)阻斷STAT3信號(hào)通路,可誘導(dǎo)Treg分化及抑制Th17分化,從而調(diào)控Th17/Treg平衡[24]。說(shuō)明Th17和Treg細(xì)胞失衡與STAT3的異常表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HSPN小鼠腎臟組織中IL-23、p-STAT3/STAT3蛋白水平均高于正常小鼠；給予甘草酸銨治療后，HSPN小鼠腎臟組織中IL-23和p-STAT3/STAT3蛋白表達(dá)水平均降低；提示甘草酸銨可下調(diào)IL-23的表達(dá)，抑制STAT3活化。鑒于以上研究結(jié)果，推測(cè)甘草酸銨可能通過(guò)IL-23/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡。

綜上所述，甘草酸銨對(duì)HSPN小鼠具有保護(hù)作用，可減輕HSPN小鼠腎損傷；其作用機(jī)制可能與抑制IL-23/STAT3通路的活化，調(diào)節(jié)HSPN小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡有關(guān)。但本研究尚存在一定的不足，未設(shè)置通路激活劑組進(jìn)行驗(yàn)證，此外，由于條件限制，本研究只在動(dòng)物水平進(jìn)行了驗(yàn)證，下一步可從細(xì)胞水平上進(jìn)行探討。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙利平：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；梁衛(wèi)章：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張俊民、代寶春：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；姜紅、劉秀珍：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析