沈宏宇，何川，余娟，唐亞麗

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由異常成髓細(xì)胞(最常見于骨髓)的積聚而導(dǎo)致骨髓衰竭和死亡的疾病[1-2]。AML是成人最常見的急性白血病，約占80%[3]。在美國，AML的發(fā)病率為3/10萬～5/10萬，2019年估計有21 450例新病例被診斷，超過1萬例患者死于該病[4]。雖然AML治療的進(jìn)展已使年輕患者的預(yù)后顯著改善，但在新病例中占大多數(shù)的老年患者預(yù)后仍然很差。因此，探究AML復(fù)發(fā)的影響因素及其臨床意義十分重要。微小RNA-182-5p(microRNA-182-5p，miR-182-5p)屬于miR-183-96-182簇，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織及乳腺癌組織中miR-182-5p表達(dá)上調(diào)[6-7]。同源盒基因A9(homeobox gene A9，HOXA9)是同源盒基因的一員，是原始造血細(xì)胞增殖、分化的重要調(diào)控因子[8]。HOXA9在AML中存在異常表達(dá)，被公認(rèn)為是AML中失調(diào)的基因[9-10]。因此，本研究通過檢測AML患者血清miR-182-5p和HOXA9信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平，探究其對AML患者復(fù)發(fā)的影響及預(yù)測價值，以期為臨床預(yù)測AML的復(fù)發(fā)提供一定依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年4月—2020年3月四川大學(xué)華西醫(yī)院血液內(nèi)科收治的AML患者110例作為研究對象，男65例，女45例，年齡35～79(45.93±5.89)歲，患者均根據(jù)“成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2017年版) ”[11]中的方法進(jìn)行治療，根據(jù)治療后1年內(nèi)是否復(fù)發(fā)，分為AML緩解組(75例，1年內(nèi)未復(fù)發(fā))和AML復(fù)發(fā)組(35例，1年內(nèi)復(fù)發(fā))，2組間臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。另選取同期在醫(yī)院體檢健康者50例作為健康對照組，男29例，女21例，年齡32～75(46.18±5.22)歲；吸煙史7例(14.0%)，飲酒史12例(24.0%)，其性別、年齡、吸煙、飲酒史均與AML患者匹配。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過(審批號：2018-02-17B)，所有受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組AML患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical databetween two groups of AML patients

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 所有患者均符合AML診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；復(fù)發(fā)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)“復(fù)發(fā)難治性急性髓系白血病中國診療指南(2017年版) ”中的相關(guān)內(nèi)容[12]。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者參與本項研究前未接受放療、化療或分子靶向治療；②患者病歷資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療后未達(dá)到完全緩解的患者；②伴有多細(xì)胞系病態(tài)造血的AML或由于治療導(dǎo)致的AML和骨髓增生異常綜合征患者；③有嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝腎功能衰竭等疾?。虎芎喜⒆陨砻庖咝约膊〉幕颊?。

1.3 觀測指標(biāo)與方法 患者在入院后次日治療前、體檢健康者于體檢時經(jīng)肘靜脈穿刺抽取外周血5 ml，靜置30 min，室溫下離心(離心機(jī)型號DT5-6，購自北京時代北利離心機(jī)有限公司)留取血清，分裝血清于2個EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?份用于檢測實驗室指標(biāo)，另1份用于檢測血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平。

1.3.1 實驗室相關(guān)指標(biāo)檢測：采用全自動血液分析儀(型號HF-240-200，購自濟(jì)南童鑫生物科技有限公司)檢測受試者初診時白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(shù)(PLT)、骨髓原始細(xì)胞、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等；受試者均行骨髓穿刺(穿刺位置為骼后上棘)，抽取骨髓液0.2 ml，進(jìn)行涂片觀察，計數(shù)200個有核細(xì)胞，計算骨髓原始細(xì)胞比例。

1.3.2 血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平檢測：按照Trizol法(購自美國Invirotrogen公司)提取血清中總RNA，分光光度計測定總RNA純度及濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海吉至生化科技有限公司)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照PCR試劑盒(購自大連TaKaRa公司)說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)(qRT-PCR儀型號7300，購自美國Applied biosygtems公司)，miR-182-5p選用U6作為內(nèi)參，HOXA9 mRNA選用GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：60℃ 20 s、 72℃ 15 s、95℃ 10 s、95℃ 1 min，共40個PCR循環(huán)。miR-182-5p、HOXA9 mRNA、U6、GAPDH引物序列見表2。引物由武漢源深生物科技有限公司設(shè)計合成。采用2-ΔΔCt方法計算血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA相對表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列Tab.2 Primer sequence for qRT-PCR

2 結(jié) 果

2.1 3組實驗室相關(guān)指標(biāo)比較 3組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。健康對照組、AML緩解組、AML復(fù)發(fā)組初診時WBC水平、骨髓原始細(xì)胞比例依次升高，Hb、PLT水平依次降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 3組受試者實驗室相關(guān)指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of laboratory related indexes of three groups of subjects

2.2 3組血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平比較 健康對照組、AML緩解組、AML復(fù)發(fā)組血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA表達(dá)水平依次升高(P<0.01)，見表4。

表4 3組受試者血清miR-182-5p和HOXA9mRNA表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison of serum miR-182-5p andHOXA9 mRNA expression levels in three groups

2.3 AML患者血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 Mirtarbase網(wǎng)站預(yù)測，miR-182-5p與HOXA9 mRNA具有靶向關(guān)系，見圖1。Pearson法分析結(jié)果顯示，血清miR-182-5p與HOXA9 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.519，P=0.000)。

圖1 miR-182-5p與HOXA9的靶向關(guān)系(箭頭標(biāo)注為結(jié)合位點)

2.4 二元Logistic回歸分析AML患者復(fù)發(fā)的影響因素 以AML患者是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)為因變量，以血清WBC、Hb、PLT、骨髓原始細(xì)胞比例、miR-182-5p、HOXA9 mRNA表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA水平高表達(dá)是影響AML患者復(fù)發(fā)的危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 二元Logistic回歸分析AML患者復(fù)發(fā)的影響因素Tab.5 Binary Logistic regression analysis of influencing factors of recurrence in patients with AML

2.5 血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平預(yù)測AML復(fù)發(fā)的價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA預(yù)測AML復(fù)發(fā)的AUC為0.741、0.836，二者聯(lián)合檢測預(yù)測AML復(fù)發(fā)的AUC為0.861，優(yōu)于單獨檢測(Z=2.919、1.682，P=0.004、0.046)，見表6、圖2。

表6 血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平預(yù)測AML復(fù)發(fā)的價值比較Tab.6 Comparison on the value of serum miR-182-5p and HOXA9 mRNA levels in predicting the recurrence of AML

圖2 血清miR-182-5p和HOXA9 mRNA表達(dá)水平診斷AML復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討 論

AML是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，通常會導(dǎo)致致命的感染、出血、器官浸潤等現(xiàn)象。AML的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，職業(yè)因素、環(huán)境因素及遺傳因素均可造成AML的發(fā)生，目前尚不十分清楚。AML的治療以化療為主，但是我國有接近70%的AML患者在治療并出院后，會出現(xiàn)復(fù)發(fā)并且逐步惡化為難治性白血病，最終死亡[13-14]，這也給患者家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，為幫助臨床醫(yī)生更高效地預(yù)測AML是否復(fù)發(fā)，改善AML的治療策略，盡早確定AML復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)志物十分必要。

miRNA目前被認(rèn)為在幾乎所有的生理過程中都起作用，并與包括癌癥在內(nèi)的許多人類疾病有關(guān)，在這些疾病中，miRNA既可以作為癌基因也可以作為腫瘤抑制因子[15-16]。血液學(xué)惡性腫瘤也不例外，由于miRNA表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致了許多不同造血譜系的血癌[17-18]。miR-182-5p是高度保守的miRNA，是miR-182的酶切產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中呈高表達(dá)[6-7]，但在AML中研究較少。HOXA9是一種同源的轉(zhuǎn)錄因子，是HOX家族中研究最深入的因子，能夠?qū)е露喾N惡性疾病，與白血病的發(fā)生有關(guān)[19]。HOXA9的異常表達(dá)，由多種癌基因驅(qū)動，是急性白血病的一個普遍特征，大約50%的人類AML和B型、T型前體急性淋巴細(xì)胞白血病的亞型中HOXA9均呈現(xiàn)過表達(dá)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，健康對照組、AML緩解組、AML復(fù)發(fā)組血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA表達(dá)水平依次升高，與既往研究相似[6-7,20]。提示血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA可能與AML有關(guān)，其表達(dá)水平升高可能造成AML的復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過與已知的癌基因或抑癌基因直接在mRNA水平上靶向結(jié)合，或與這些蛋白協(xié)同作用促進(jìn)惡性腫瘤，從而影響白血病的發(fā)生和進(jìn)展[21]。本研究中血清miR-182-5p與HOXA9 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。提示二者可能共同促進(jìn)AML的進(jìn)展，猜測是由于AML患者機(jī)體功能障礙促使二者出現(xiàn)代償性升高，但具體機(jī)制仍不清楚。二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的miR-182-5p、HOXA9 mRNA與AML的復(fù)發(fā)有關(guān)，猜測可能是miR-182-5p通過靶向HOXA9基因，促使HOXA9蛋白表達(dá)異常，引起造血細(xì)胞分化、成熟過程發(fā)生改變，使機(jī)體造血能力降低，進(jìn)而導(dǎo)致AML的發(fā)生。此外，ROC分析顯示，血清miR-182-5p、HOXA9 mRNA對AML復(fù)發(fā)均有一定的預(yù)測價值，聯(lián)合檢測預(yù)測價值更高，表明二者均可能作為潛在的AML復(fù)發(fā)診斷標(biāo)志物。

綜上所述，AML患者血清中miR-182-5p、HOXA9 mRNA表達(dá)水平均升高，二者呈正相關(guān)，對AML復(fù)發(fā)具有一定預(yù)測價值，可能作為潛在的AML復(fù)發(fā)診斷標(biāo)志物。本研不足是未分析患者骨髓中miR-182-5p、HOXA9 mRNA水平，二者與AML的關(guān)系及臨床預(yù)測價值有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

沈宏宇：提出研究思路，設(shè)計研究方案，課題設(shè)計，論文撰寫，論文修改；何川：分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；余娟：實施研究過程，資料搜集整理；唐亞麗：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析