張靜，劉爽，王潔，姚淑暉，宋晶晶，熊偉，黃曉智

大部分肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌類型，其發(fā)病率逐年上升且早期癥狀不典型，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已處于晚期[1]。盡管目前放射治療等非小細(xì)胞肺癌治療技術(shù)不斷進(jìn)步，更加多樣化和個(gè)體化，但其總體治療效果仍不理想[2]。因此，探尋非小細(xì)胞肺癌放療抵抗的相關(guān)指標(biāo)及機(jī)制，提高放療敏感性，可能對(duì)改善預(yù)后有重要意義。微小RNA-139-5p(microRNA-139-5p，miR-139-5p)是與多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性有關(guān)的微小核糖核酸[3]。You等[4]研究顯示，miR-139-5p與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。Song等[5]研究顯示，鈣黏蛋白相關(guān)蛋白(cadherin-associated protein beta 1，CTNNB1，又稱β-catenin)是非小細(xì)胞肺癌中微小核糖核酸調(diào)控機(jī)制中的潛在靶基因。而既往研究顯示，miR-139-5p與CTNNB1存在靶向調(diào)控關(guān)系[6]?，F(xiàn)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中miR-139-5p、CTNNB1蛋白的表達(dá)及其與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征、放射敏感性的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月—2021年5月于唐山市人民醫(yī)院放化七科和腫瘤內(nèi)科就診且經(jīng)組織病理學(xué)及胸部影像學(xué)等確診的非小細(xì)胞肺癌患者156例為研究對(duì)象(研究組)，患者均不適宜手術(shù)治療并采用放射治療，其中男89例，女67例；年齡46～78(60.48±10.26)歲，<60歲82例，≥60歲74例；腫瘤直徑：<3.0 cm 70例，≥3.0 cm 86例；腫瘤位置：中央型78例，周圍型78例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移80例；組織分化程度：中/高分化72例，低分化84例；TNM分期[7]：Ⅱ～Ⅲ期69例，Ⅳ期87例；肺腺癌74例(腺癌亞組)，肺鱗癌82例(鱗癌亞組)；通過經(jīng)皮肺穿刺活檢獲取患者肺病變組織。另選取手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者86例，男51例，女35例,年齡45～79(61.04±10.57)歲；術(shù)中獲取癌旁正常肺組織作為對(duì)照組。2組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(RMYY-LLKS-2017-003)，且所有受試者均自愿參加、知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①非小細(xì)胞肺癌患者均符合“中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版) ”中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②入組前未接受過放化療等治療者；③一般資料齊全。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或哺乳期婦女；②有精神障礙或認(rèn)知功能障礙疾病者；③伴有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；④有嚴(yán)重肝腎等臟器功能異常，其他感染性疾病或免疫性疾病者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 放射敏感性：研究組患者入院后，仰臥，采用熱塑體膜固定，并采用CT定位，勾畫出腫瘤靶區(qū)及重要器官，制定相應(yīng)放療計(jì)劃。入組患者均實(shí)施三維適形調(diào)強(qiáng)放射治療，劑量根據(jù)患者具體情況而定，總劑量為6 000～7 000 cGy，每次放療劑量200 cGy，平均每周5次，觀察病變范圍和體積變化。

1.3.2 miR-139-5p表達(dá)水平檢測(cè)：采用RNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Life公司)提取肺癌和癌旁正常肺組織總RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自上海杏園瑞民生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào) CFX384)、PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，購(gòu)自日本Takara公司)、熒光定量PCR參比染料(Rox reference dye，購(gòu)自南京北魚生物科技有限公司)對(duì)miR-139-5p及其內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增，引物由南京北魚生物科技有限公司合成(引物序列見表1)。 qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板(50 ng/μl)2 μl，上下游引物各0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，Rox reference dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-139-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 CTNNB1蛋白表達(dá)檢測(cè)：將肺癌和癌旁正常肺組織用10%甲醛固定標(biāo)本后，進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織CTNNB1蛋白表達(dá)，其操作步驟按照免疫組織化學(xué)試劑盒(購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司)說明書嚴(yán)格進(jìn)行，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性的肺組織切片作陽性對(duì)照。隨機(jī)選10個(gè)視野(10×40)在顯微鏡(購(gòu)自日本OLYMPUS公司，型號(hào) CX23)下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色定義為陽性細(xì)胞。采用半定量法評(píng)分，按染色強(qiáng)度計(jì)分：棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無著色計(jì)0分；按陽性細(xì)胞比例計(jì)分：陽性細(xì)胞比例<1/3計(jì)1分，1/3～2/3計(jì)2分，>2/3計(jì)3分。根據(jù)兩者乘積為最終得分判定表達(dá)情況，≤2分為陰性表達(dá)，>2分為陽性表達(dá)[9]。

1.4 放療敏感性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 觀察病變范圍和體積變化，采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.1)[10]評(píng)定放療敏感性：腫瘤增大>20%，或出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)新病灶為進(jìn)展(進(jìn)展亞組，28例)；腫瘤增大≤20%或減少≤50%為穩(wěn)定(穩(wěn)定亞組，42例)；腫瘤完全消失為完全緩解，腫瘤減少>50%為部分緩解(緩解亞組，86例)。

2 結(jié) 果

2.1 各組組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)比較 研究組癌組織miR-139-5p表達(dá)水平低于對(duì)照組，CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率高于對(duì)照組(P均<0.05)；腺癌亞組與鱗癌亞組miR-139-5p表達(dá)水平、CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 對(duì)照組、研究組及2亞組miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of miR-139-5p and CTNNB1 proteinexpression between control group, study group and two subgroups

2.2 肺癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)在不同臨床/病理特征中差異的比較 根據(jù)非小細(xì)胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)患者癌組織miR-139-5p表達(dá)水平平均值(0.62)及CTNNB1蛋白是否陽性表達(dá)，將其分為miR-139-5p低表達(dá)79例(miR-139-5p表達(dá)水平<0.62)，miR-139-5p高表達(dá)77例(miR-139-5p表達(dá)水平≥0.62)；CTNNB1蛋白陰性表達(dá)50例，CTNNB1蛋白陽性表達(dá)106例。miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌患者不同性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型、腫瘤位置方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-139-5p低表達(dá)患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度低、TNM分期Ⅳ期患者比例高于miR-139-5p高表達(dá)患者(P<0.01)；CTNNB1蛋白陰性表達(dá)患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度低、TNM分期Ⅳ期患者比例低于CTNNB1蛋白陽性表達(dá)患者(P<0.01)，見表3。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)在不同臨床/病理特征中差異的比較 [例(%)]Tab.3 Comparison of miR-139-5p and CTNNB1 protein expression in different clinical/pathological features of patients with NSCLC

2.3 肺癌組織miR-139-5p表達(dá)與CTNNB1蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman分析結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌患者癌組織miR-139-5p表達(dá)水平與CTNNB1蛋白陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.503，P=0.000)。

注：A.癌旁正常肺組織CTNNB1蛋白陽性表達(dá)；B.肺腺癌組織CTNNB1蛋白陽性表達(dá)；C.肺鱗癌組織CTNNB1蛋白陽性表達(dá)；D.癌旁正常肺組織CTNNB1蛋白陰性表達(dá)；E.肺腺癌組織CTNNB1蛋白陰性表達(dá)；F.肺鱗癌組織CTNNB1蛋白陰性表達(dá)

2.4 肺癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)與放射敏感性的關(guān)系 結(jié)果顯示，緩解亞組、穩(wěn)定亞組、進(jìn)展亞組miR-139-5p低表達(dá)率及CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率依次升高(P<0.05)，見表4。

表4 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達(dá)與放射敏感性的關(guān)系 [例(%)]Tab.4 Relationship between the expression of miR-139-5p,CTNNB1 protein and radiosensitivity in patients with NSCLC

2.5 影響非小細(xì)胞肺癌患者放射敏感性的多因素Logistic分析 將非小細(xì)胞肺癌患者放射治療后是否出現(xiàn)進(jìn)展作為因變量，以miR-139-5p、CTNNB1蛋白、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，CTNNB1蛋白陽性表達(dá)、TNM分期高是影響放射敏感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，miR-139-5p高表達(dá)是影響放射敏感性的保護(hù)因素(P<0.01)，見表5。

表5 非小細(xì)胞肺癌患者放射敏感性影響因素的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis on influence factors of radiosensitivity in patients with NSCLC

3 討 論

肺癌作為一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，是世界上癌癥死亡的主要原因之一[11-12]。肺癌中最常見的組織類型是非小細(xì)胞肺癌，其具體分子機(jī)制尚未十分明確，最常見的亞型為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌[13]。盡管目前放射治療技術(shù)日益更新，但非小細(xì)胞肺癌臨床總體治療效果仍處于平臺(tái)期，尤其是放療不敏感常會(huì)引起肺癌治療失控[14]。因此，如何預(yù)測(cè)或提高放射治療敏感性是現(xiàn)階段醫(yī)學(xué)研究需要關(guān)注的關(guān)鍵問題。

微小核糖核酸是一種基因表達(dá)調(diào)控分子，為癌癥分子機(jī)制及放化療敏感性的研究提供了新的機(jī)遇[15]。本研究中miR-139-5p在肺鱗癌和肺腺癌患者癌組織中均呈異常低表達(dá)，且表達(dá)水平在2種病理亞型間無顯著差異，提示miR-139-5p在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起抑癌基因作用，與You等[4]研究結(jié)果一致。CTNNB1是鈣黏蛋白家族一員，早期被認(rèn)為是一種黏附因子，在細(xì)胞間的黏附過程中扮演重要角色[16-17]。游離型CTNNB1可進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移等進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[18]。本結(jié)果顯示，CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中呈高水平，且與miR-139-5p呈負(fù)相關(guān)。結(jié)合既往研究，推測(cè)在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中，miR-139-5p與CTNNB1蛋白間可能有調(diào)控作用，二者共同參與疾病進(jìn)展。本研究進(jìn)一步探討miR-139-5p、CTNNB1蛋白的生物學(xué)功能，結(jié)果表明，二者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期有關(guān)。推測(cè)miR-139-5p低表達(dá)可上調(diào)CTNNB1蛋白表達(dá)量，CTNNB1蛋白通過進(jìn)一步作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，推動(dòng)疾病進(jìn)展。相關(guān)研究表明，miR-139-5p及其相關(guān)通路與前列腺癌的放療敏感性及卵巢癌的順鉑敏感性有關(guān)[19-20]。He等[21]研究顯示，miR-541-3p可通過下調(diào)CTNNB1增加前列腺癌細(xì)胞的放射敏感性。而本結(jié)果中，放療療效最差的進(jìn)展亞組非小細(xì)胞肺癌患者，其miR-139-5p低表達(dá)率和CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率最高，表明CTNNB1蛋白、miR-139-5p與放療療效及放射敏感性有一定相關(guān)性，推測(cè)miR-139-5p低表達(dá)通過上調(diào)CTNNB1蛋白表達(dá)水平靶向作用于癌細(xì)胞，調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示，臨床中需要密切監(jiān)測(cè)CTNNB1高表達(dá)、miR-139-5p低表達(dá)、TNM分期為Ⅳ期的患者，針對(duì)此類患者制定個(gè)體化治療措施，提高放療敏感性。

綜上所述，在非小細(xì)胞肺癌組織中，miR-139-5p表達(dá)水平下降、CTNNB1蛋白陽性表達(dá)率升高，二者可能分別發(fā)揮抑制和促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，且一定程度上影響放射敏感性。然而本研究存在一定的不足之處，miR-139-5p低表達(dá)后，CTNNB1蛋白的上調(diào)可能伴隨或?qū)е缕渌嚓P(guān)基因表達(dá)的變化，有待今后納入更多樣本，采用多層次、多中心的試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張靜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；劉爽、王潔：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；姚淑暉、宋晶晶：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；熊偉：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；黃曉智：課題設(shè)計(jì)