彭侃霖，周 豪，劉 戎，孫 堅(jiān)，丘鏡莉，熊仁萍，賀利民

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

霉酚酸 (Mycophenolic acid)是青霉菌Penicillium產(chǎn)生的弱酸性次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，具有一定的抗霉菌、抗細(xì)菌和抗病毒活性[2-3]，也是霉酚酸酯(Mycophenolate mofetil)在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，可抑制器官移植時(shí)的排異反應(yīng)[4]。全球約25%的農(nóng)作物受到霉菌毒素的污染[5]，青貯飼料作為反芻動(dòng)物的重要飼料，在加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸時(shí)，處理不當(dāng)容易產(chǎn)生霉變。青霉菌是霉變青貯飼料中常見(jiàn)的菌株[6]，青貯飼料中霉酚酸平均含量可達(dá)256～7 656 μg/kg[7-9]。霉變青貯飼料中毒素成分復(fù)雜，逐一檢測(cè)較為困難，而霉酚酸作為青霉菌污染飼料的標(biāo)志物，在受污染青貯飼料中具有代表性，可間接反映青貯飼料中霉菌毒素的水平[1]。此外，動(dòng)物如果長(zhǎng)期暴露于含霉酚酸的青貯飼料環(huán)境下，免疫力下降，容易受感染性疾病的侵襲[10]。因此建立能準(zhǔn)確可靠地測(cè)定青貯飼料中霉酚酸含量的方法，從而評(píng)價(jià)青貯飼料的質(zhì)量具有實(shí)踐意義。

基質(zhì)中霉酚酸檢測(cè)的報(bào)道常見(jiàn)于血漿[11]和尿液[12]中，也以瘤胃液作為基質(zhì)[13]，而霉酚酸分析測(cè)定方法大多只是經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的前處理[14]，缺乏特異性，檢測(cè)易受干擾，研發(fā)新的高選擇性凈化方法十分必要。分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)對(duì)目標(biāo)物的結(jié)合具有特異性，結(jié)合固相萃取技術(shù)，采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)法[15]可檢測(cè)人血漿中的霉酚酸，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS)法[5]可完成對(duì)青貯飼料中霉酚酸的檢測(cè)；然而采用本體聚合法制備的聚合物存在傳質(zhì)速度慢、識(shí)別位點(diǎn)被包裹和模板難以洗脫等缺陷[16-17]。以硅膠作為載體的表面分子印跡聚合技術(shù)是一種在硅膠表面發(fā)生印跡的方法[18]，目標(biāo)物傳質(zhì)速度快，模板洗脫容易；因此，本研究探究了霉酚酸-硅膠表面分子印跡聚合物的合成，作為固相萃取吸附填料評(píng)價(jià)其對(duì)霉酚酸的吸附保留能力，最后構(gòu)建分子印跡固相萃取-HPLC法測(cè)定青貯飼料中霉酚酸含量，為青貯飼料中霉菌毒素污染水平的監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260 型高效液相色譜儀 (Agilent公司)，SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)，KH7200DB型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，Velocity 18R高速冷凍離心機(jī)(Dynamica公司)，EVOMA 15掃描式電子顯微鏡(ZEISS 公司)。

霉酚酸酯原料藥(上海源葉生物科技有限公司)、霉酚酸均購(gòu)自MedChemExpress公司。硅膠購(gòu)自Silicycle公司，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)、甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸-2-羥基乙酯(HEMA)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，2-乙烯基吡啶(2-VP)和4-乙烯基吡啶(4-VP)購(gòu)自Alfa Aesar公司，丙烯酰胺(AM)購(gòu)自上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司，衣康酸(IA)購(gòu)自J＆K Scientific公司。丙酮、三氯甲烷購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，甲醇、乙腈均為色譜純，超純水由Millipore MilliQ系統(tǒng)制備，青貯飼料由某飼料廠提供。

1.2 方法

1.2.1 SiO2-MPS 的制備 稱 5 g 干燥硅膠于 150 mL圓底燒瓶中，加入適量6 mol/L鹽酸，混勻后于80 ℃油浴中攪拌10 h，冷卻至室溫后，離心棄上清液，沉淀物不斷用水洗滌至中性，60 ℃真空干燥24 h，得到活化硅膠[19]。

取5 g活化硅膠于三頸圓底燒瓶中，依次加入100 mL 無(wú)水甲苯、5 mLγ-MPS 和 1 mL 三乙胺，混勻，在氬氣保護(hù)下，120 ℃條件下加熱回流12 h。將混合物離心棄上清液，沉淀依次用甲醇、超純水交替洗滌，60 ℃條件下真空干燥，得到SiO2-MPS(改性硅膠)。1.2.2 SiO2-MPS@MIP 的制備 將 1 mmol的霉酚酸酯溶于 80 mL 乙腈中，加入 2 mmol MAA，渦旋、超聲混勻，在冰浴下磁力攪拌6 h后，依次加入0.6 g SiO2-MPS、20 mmol EGDMA 和 40 mg AIBN，超聲混勻，通入氬氣 10 min，密封，60 ℃ 油浴下磁力攪拌24 h。將聚合物依次用甲醇、超純水和φ為10%的乙酸甲醇溶液洗滌，用超純水、甲醇去除殘留的乙酸，直到檢測(cè)不到模板分子后，于60 ℃ 條件下真空干燥 24 h，備用。

SiO2-MPS@NIP的制備：不加入霉酚酸酯，將2 mmol MAA 溶于 80 mL 乙腈中，超聲混勻、磁力攪拌后加入與制備SiO2-MPS@MIP相同量的SiO2-MPS、EGDMA和 AIBN，混勻后通氮?dú)?，密封?0 ℃油浴下磁力攪拌24 h。依次用水和甲醇洗滌SiO2-MPS@NIP后，于 60 ℃ 條件下真空干燥 24 h，備用。

1.2.3 材料的表征 通過(guò)掃描電鏡觀察活化硅膠、SiO2-MPS、SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的形貌特征。

1.2.4 吸附試驗(yàn) 稱取 20 mg 干燥聚合物粉末于25 mL玻璃錐形瓶中，加入5 mL含有一定濃度霉酚酸的乙腈溶液，25 ℃條件下在恒溫振蕩水浴鍋中振蕩 24 h，4 000 r/min 離心 10 min，取上清液并過(guò)0.22 μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定。每個(gè)濃度準(zhǔn)備3份平行樣，取算術(shù)平均值。吸附量(Q)按照公式(1)計(jì)算，印跡因子 (Impringting factor,IF)按公式 (2)計(jì)算。

式中，Q為吸附量，mg/g； ρ0和ρe分別是霉酚酸的初始質(zhì)量濃度和達(dá)平衡時(shí)上清液中霉酚酸的質(zhì)量濃度，mg/L；V為溶液體積，mL；m為稱取的聚合物質(zhì)量，mg；QMIP和QNIP分別為 SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的吸附量，mg/g。

1.2.5 分子印跡固相萃取柱制備及固相萃取試驗(yàn)

將制備好的干燥聚合物裝填于1 mL聚丙烯固相萃取空柱中，兩端用配套的濾板封堵，輕輕壓實(shí)，制備成分子印跡固相萃取(Molecularly imprinted polymer solid phase extraction)小柱。固相萃取柱依次用 1 mL 的甲醇、超純水活化，1mL 100 mg/L 的霉酚酸溶液上樣，1 mL 10%(φ)甲醇溶液淋洗和2%(φ)乙酸甲醇溶液洗脫，洗脫溶液吹干后用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

1.2.6 樣品的前處理過(guò)程 稱取 5 g 青貯飼料，添加適量霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，室溫下靜置20 min。加入20 mL乙腈，經(jīng)提取、振蕩、離心后取10 mL上清液吹至近干，用2 mL酸性水(pH=6)溶解殘留物，過(guò)固相萃取小柱，按“1.2.5”處理，上機(jī)測(cè)定。

1.2.7 HPLC 條件 色譜柱：Aglient Extend-C18 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流動(dòng)相：A相為乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸)，B相為體積分?jǐn)?shù)為0.3%的甲酸溶液，流動(dòng)相比例為VA∶VB= 60∶40；流速：1 mL /min；進(jìn)樣量：20 μL。1.2.8 霉酚酸檢測(cè)方法的評(píng)價(jià) 采用色譜純乙腈稀釋霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成 0.5、1、2、5、10、20、50、100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC檢測(cè)。以吸收峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向空白青貯飼料中添加適量霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后上機(jī)檢測(cè)，以3倍(S/N≥3)和10倍(S/N≥10)信噪比作為檢測(cè)限和定量限。

向空白青貯飼料中添加霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低 (200 μg/kg)、中 (2 000 μg/kg)和高 (8 000 μg/kg)3個(gè)添加水平，前處理后上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣，測(cè)定3批次，以同一批次和3批次的平均回收率作為日內(nèi)和日間回收率，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation)表示精密度。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件分析，采用Origin 2019b繪制統(tǒng)計(jì)圖，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著性差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物制備條件的優(yōu)化

2.1.1 致孔劑的選擇 乙腈作為致孔劑時(shí)SiO2-MPS@MIP吸附量最高，為3.7 mg/g，印跡因子達(dá)到2.1。如表1所示，向乙腈中添加少量三氯甲烷時(shí)，SiO2-MPS@MIP吸附量下降，隨著三氯甲烷添加比例的升高，吸附量呈現(xiàn)先增大后降低最后穩(wěn)定的趨勢(shì)；SiO2-MPS@NIP的吸附量隨著三氯甲烷添加比例的升高而增加，最后與SiO2-MPS@MIP的吸附量基本一致；印跡因子呈下降趨勢(shì)。當(dāng)致孔劑全為三氯甲烷時(shí)，聚合物呈塊狀，不適合進(jìn)一步試驗(yàn)。后續(xù)試驗(yàn)以乙腈為致孔劑。

表1 乙腈溶液中不同三氯甲烷添加比例對(duì)S i O2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP吸附量的影響Table 1 The influence of different addition proportions of chloroform in acetonitrile on the adsorption capacity of SiO2-MPS@MIP and SiO2-MPS@NIP

2.1.2 模板和單體的優(yōu)化 選擇霉酚酸的結(jié)構(gòu)類似物霉酚酸酯作為虛擬模板，比較了堿性單體(2-VP和4-VP)、中性單體(AM和HEMA)和酸性單體(IA和MAA)對(duì)印跡因子的影響，結(jié)果如圖1A所示，MAA合成時(shí)印跡因子顯著高于其他組合(P＜0.05)，2-VP和HEMA參與合成時(shí)印跡因子無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于單體為AM和IA時(shí)的印跡因子 (P＜0.05)。

圖1 不同單體種類(A)和不同模板單體摩爾比(B)對(duì)印跡因子的影響Fig.1 The influence of different monomer types (A) and different mole ratios of template to monomer (B) on impringting factor

考察不同的模板單體摩爾比 (1∶1、1∶2、1∶4、1∶6和1∶8)對(duì)印跡因子的影響，結(jié)果如圖1B所示，模板單體摩爾比為1∶2時(shí)，印跡因子顯著高于其他組合 (P＜0.05)，模板單體摩爾比為 1∶1和 1∶4時(shí)印跡因子之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但均顯著高于模板單體摩爾比為1∶6和1∶8時(shí)的印跡因子(P＜0.05)。

2.2 聚合物的表征

2.2.1 聚合物表面形貌觀察 對(duì)活化硅膠、SiO2-MPS、SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP進(jìn)行掃描電鏡分析，結(jié)果如圖2所示，活化硅膠和SiO2-MPS表面光滑，而SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP表面粗糙，均有聚合物包裹在硅球表面，包裹在SiO2-MPS@NIP表面的聚合物更多且致密。

圖2 活化硅膠(A)、SiO2-MPS (B)、SiO2-MPS@MIP(C)和SiO2-MPS@NIP(D)的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope images of activated silica gel (A),SiO2-MPS (B),SiO2-MPS@MIP (C) and SiO2-MPS@NIP (D)

2.2.2 聚合物吸附性能的研究 靜態(tài)吸附試驗(yàn)研究了霉酚酸不同初始濃度對(duì)聚合物吸附量的影響，結(jié)果如圖3A所示，在10～250 mg/L范圍內(nèi)，隨著霉酚酸質(zhì)量濃度的增加，SiO2-MPS@NIP和SiO2-MPS@MIP的吸附量增加，SiO2-MPS@MIP在霉酚酸質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)趨于飽和，飽和吸附量為 4.5 mg/g。

圖3 SiO2-MPS@MIP和SiO2-MPS@NIP的靜態(tài)(A)和動(dòng)態(tài)(B)吸附曲線Fig.3 Static (A) and dynamic (B) adsorption curves of SiO2-MPS@MIP and SiO2-MPS@NIP

動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)研究了吸附時(shí)間對(duì)聚合物吸附量的影響，在質(zhì)量濃度為100 mg/L的霉酚酸溶液下進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，結(jié)果如圖3B所示，SiO2-MPS@NIP在30 min內(nèi)達(dá)到吸附平衡，SiO2-MPS@MIP在30 min內(nèi)吸附速率較快，60 min時(shí)達(dá)到吸附平衡。

2.3 分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 上樣溶液對(duì)霉酚酸回收率的影響 研究甲醇、乙腈、三氯甲烷和超純水為上樣溶液對(duì)霉酚酸回收率的影響，如圖4A所示，超純水作上樣溶液時(shí)分子印跡固相萃取柱對(duì)霉酚酸的回收率可達(dá)到90%以上，高于非印跡固相萃取柱。在實(shí)際樣品的考察中，比較不同pH水作為上樣溶液過(guò)分子印跡固相萃取柱的效果，結(jié)果如圖4B所示，隨著pH的增加，分子印跡固相萃取柱和非印跡固相萃取柱對(duì)霉酚酸的回收率先增加后下降，在pH為6的時(shí)候分子印跡固相萃取柱的回收率最高，高于非印跡固相萃取柱的。

圖4 不同上樣溶液(A)及不同pH水(B)對(duì)霉酚酸回收率的影響Fig.4 The influences of different loading solutions (A) and different pH water (B) on mycophenolic acid recovery rate

2.3.2 淋洗溶液及洗脫溶液對(duì)霉酚酸回收率的影響

分別采用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液(1%、5%、10%和20%)和乙腈溶液(10%和20%)淋洗，如圖5A所示，分子印跡固相萃取柱對(duì)霉酚酸的回收率高于非印跡固相萃取柱。與乙腈溶液相比，采用甲醇溶液淋洗分子印跡固相萃取柱時(shí)霉酚酸回收率高，損失小。當(dāng)甲醇溶液中甲醇體積分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，有機(jī)相含量增加，回收率下降；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在10%以下時(shí)，回收率均大于90%。與體積分?jǐn)?shù)為1%和5%甲醇溶液相比，體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇溶液中有機(jī)相比例更高，容易除去實(shí)際樣品中脂溶性雜質(zhì)，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇溶液作為淋洗溶液。

圖5 不同淋洗溶液(A)和洗脫溶液(B)對(duì)霉酚酸回收率的影響Fig.5 The influences of different washing solutions (A) and elution solutions (B) on mycophenolic acid recovery rate

如圖5B所示，分別考察了體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、5%和8%的乙酸甲醇溶液洗脫的效果，結(jié)果表明，分子印跡固相萃取柱對(duì)霉酚酸的回收率高于非印跡固相萃取柱，適當(dāng)增加乙酸的比例可以有效提高洗脫的效率，但是酸過(guò)多時(shí)回收率基本保持不變，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸甲醇溶液為洗脫溶液即可。

2.4 霉酚酸檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

霉酚酸在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性良好(R2=0.999)，檢測(cè)限和定量限分別為 60 和 200 μg/kg。過(guò)分子印跡固相萃取柱前后HPLC色譜圖見(jiàn)圖6，回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。霉酚酸的回收率為76.0%～81.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～6.6%。

表2 空白樣品中霉酚酸的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 2 Recovery rates of spiked mycophenolic acid and the relative standard deviation (RSD) in the blank sample

圖6 過(guò)分子印跡固相萃取柱前(A)和經(jīng)分子印跡固相萃取柱凈化后(B)的加標(biāo)青貯飼料(2 000 μg/kg)以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(C)HPLC-UVD色譜圖Fig.6 HPLC-UVD chromatograms of the spiked silage(2 000 μg/kg) before (A) and after (B) purification by the molecularly imprinted polymer solid phase extraction column and the corresponding standard solution (C)

對(duì)20份青貯飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在3份樣品中檢出霉酚酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為227、391和1 770 μg/kg，其他樣品中未檢出霉酚酸。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果顯示三氯甲烷降低了SiO2-MPS@MIP的特異性，這是因?yàn)槿燃淄闀?huì)導(dǎo)致聚合物溶脹、擠壓甚至破壞特異性孔穴，從而降低聚合物的特異性[20]。De Smet等[5]采用堿性單體 4-VP 合成，采用LC-MS/MS法檢測(cè)霉酚酸，而本研究采用酸性單體MAA進(jìn)行合成，制備的分子印跡固相萃取小柱對(duì)霉酚酸凈化效果良好，表明霉酚酸酯除了通過(guò)氫鍵與MAA在立體結(jié)構(gòu)上相匹配外，霉酚酸酯中的含氮基團(tuán)嗎啉與MAA存在靜電相互作用，增強(qiáng)了預(yù)聚物的穩(wěn)定性，從而提高了SiO2-MPS@MIP特異性識(shí)別能力。結(jié)合表征結(jié)果并分析聚合物動(dòng)靜態(tài)吸附曲線發(fā)現(xiàn)，由于硅球表面成功覆蓋了聚合物層，霉酚酸更容易進(jìn)入孔穴中，因此與De Smet等[5]采用的本體聚合法相比，表面印跡法制備的印跡聚合物達(dá)平衡時(shí)間更短，可節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間。考察聚合物裝柱后的效果，由于疏水作用參與了目標(biāo)物與印跡聚合物的識(shí)別過(guò)程[21]，促進(jìn)了霉酚酸的保留，因此上樣溶液為水時(shí)更好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，霉酚酸在過(guò)酸或過(guò)堿條件下回收率低，因?yàn)閜H較低時(shí)，過(guò)多的氫離子會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合霉酚酸中的氧原子，阻礙霉酚酸與填料之間氫鍵的形成，而pH較高時(shí)，填料中的羧基基本完全電離，也不利于霉酚酸與填料的結(jié)合[22]。

本研究利用表面印跡聚合法成功制備出對(duì)霉酚酸具有吸附特異性的硅膠表面接枝分子印跡聚合物，聚合物具有良好吸附能力和傳質(zhì)速度，建立的合成印跡聚合物固相萃取-HPLC法可凈化、富集和檢測(cè)青貯飼料中的霉酚酸，為青貯飼料的質(zhì)量安全控制提供指導(dǎo)。