吳立波，李廣華，于家興，王秋實(shí)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸外科，哈爾濱 150086)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌中肺鱗癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且男性和吸煙者多見[2]。目前外科手術(shù)、放化療和靶向治療仍是最常見的治療手段。由于肺鱗癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，患者預(yù)后較差。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物進(jìn)行早期識別是改善肺鱗癌患者預(yù)后的重要預(yù)防措施。越來越多的研究已經(jīng)確定了一些有價(jià)值的生物標(biāo)志物，如表皮生長因子受體、CD44、RRAS2(RAS related 2)、人促分裂原活化的蛋白激酶相關(guān)蛋白1和成纖維生長因子受體2等[3]。然而，預(yù)測肺鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物特異性和敏感性較低，較少被采用。DNA甲基化是一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)事件，可以影響轉(zhuǎn)錄前基因沉默、遺傳印記、X染色體失活、基因組穩(wěn)定性[4]。從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，即核小體結(jié)合的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A和3B[5-6]，主要通過甲基化CpG二核苷酸在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7]。啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化異常通常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志，其可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄沉默和癌基因的異常激活[8]。雖然目前對DNA甲基化異常與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了廣泛研究，但考慮DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因信號的個(gè)體化預(yù)后模型的報(bào)道較少。本研究通過整合甲基化和信使RNA(messenger RNA，mRNA)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，確定DNA甲基化狀態(tài)改變的預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)基因，并通過Kaplan-Meier生存分析和LASSO回歸分析建立風(fēng)險(xiǎn)評分模型，開發(fā)預(yù)測肺鱗癌患者預(yù)后的列線圖。

1 資料與方法

1.1一般資料 從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載具有臨床預(yù)后信息的肺鱗癌DNA甲基化表達(dá)數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，使用β值從0～1對基因甲基化水平進(jìn)行評分(未甲基化到完全甲基化)；使用DEseq軟件包從訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中(具有完整預(yù)后信息的TCGA-肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組的HTSeq計(jì)數(shù)，并被診斷為肺鱗癌)識別了501例肺癌組織和49例鄰近的非腫瘤性肺組織之間的差異表達(dá)基因。將絕對log2倍變化(|FC|)>2和調(diào)整后的P<0.05設(shè)為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1鑒定DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因 將基因表達(dá)數(shù)據(jù)和DNA甲基化數(shù)據(jù)整合到相同的TCGA條形碼標(biāo)簽結(jié)構(gòu)中。DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因是指MethylMix包分析[9]，DNA甲基化水平與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的基因。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較肺鱗癌組織和癌旁組織甲基化狀態(tài)的差異。

1.2.2功能富集分析 使用DAVID生信分析工具對DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)和途徑富集分析。

1.2.3特征選擇和構(gòu)建預(yù)測簽名 利用Kaplan-Meier生存分析評估DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因與肺鱗癌患者生存時(shí)間的關(guān)系。采用LASSO回歸模型和多變量Cox回歸模型進(jìn)一步縮小候選基因的范圍。多變量Cox回歸模型(β)系數(shù)乘以其mRNA水平計(jì)算包括基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)。

1.2.4開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評分模型 選擇合適的臨界值(風(fēng)險(xiǎn)得分的中位數(shù))，將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，繪制兩組Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行預(yù)測性簽名的評估。

1.2.5篩選影響預(yù)后的因素 采用單因素Cox回歸分析評價(jià)風(fēng)險(xiǎn)評分模型與其他臨床特征對肺鱗癌患者預(yù)后的影響；通過多因素Logistic回歸分析排除混雜因素。

1.2.6列線圖的開發(fā)與評價(jià) 采用多變量Cox回歸分析區(qū)分出顯著的預(yù)測因素，并由此建立預(yù)測模型。應(yīng)用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)繪制校準(zhǔn)曲線評估肺鱗癌患者3和5年生存率的校準(zhǔn)，并通過受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve，ROC曲線)評價(jià)列線圖的預(yù)測效能。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R軟件(3.5.2版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1鑒別差異性基因 肺鱗癌組織(501例)與癌旁組織(49例)的mRNA表達(dá)比較顯示，有86個(gè)基因上調(diào)，148個(gè)差異性基因下調(diào)，見圖1。

圖1 肺鱗癌組織與癌旁組織的基因差異性表達(dá)

2.2識別DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因 對412個(gè)臨床樣本(Illumina人類甲基化27平臺)的數(shù)據(jù)和癌癥組篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行MethylMix分析，共篩選了45個(gè)DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因，其甲基化水平見圖2。

GO分析共獲得了21個(gè)GO項(xiàng)(P<0.05)，基因功能在絲氨酸家族氨基酸代謝過程、細(xì)胞和細(xì)胞間黏附連接、細(xì)胞和細(xì)胞間連接方面顯著豐富(P<0.001)，見圖3。

圖2 篩選的DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因的甲基化水平

注：BP為生物過程，CC為細(xì)胞成分，MF為分子功能

2.3肺鱗癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評分模型的建立 利用Kaplan-Meier生存分析獲得4個(gè)DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因：橋粒芯膠黏蛋白3、ATP結(jié)合家族亞家族C成員5(ATP-binding cassette subfamily C member 5，ABCC5)、封閉蛋白1重組蛋白(recombinant claudin 1，CLDN1)和半胱氨酸蛋白酶蛋白A(campylobacter jejuni carbon starvation protein A，CSTA)，進(jìn)一步進(jìn)行LASSO回歸模型分析，見圖4，得出ABCC5、CLDN1和CSTA基因作為預(yù)后基因，并給出風(fēng)險(xiǎn)評分計(jì)算公式，在LASSO回歸模型中加入各基因表達(dá)水平與相關(guān)系數(shù)的乘積，建立預(yù)測模型：風(fēng)險(xiǎn)評分=(-0.007 510 048×ABCC5 mRNA)+(-0.058 068 343×CLDN1 mRNA) +(-0.047 711 368×CSTA mRNA)。ABCC5、CLDN1和CSTA在LASSO回歸中與風(fēng)險(xiǎn)評分呈負(fù)相關(guān)。對231例具有完整臨床資料肺鱗癌患者的ABCC5、CLDN1和CSTA基因的表達(dá)特征計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評分，其中高風(fēng)險(xiǎn)組115例、低風(fēng)險(xiǎn)組116例，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存期明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組(P=0.021)，見圖5。

2.4構(gòu)建肺鱗癌患者生存時(shí)間預(yù)測的列線圖 多因素Cox回歸分析顯示，年齡、TNM分期中N2分期、風(fēng)險(xiǎn)評分與肺鱗癌患者的生存時(shí)間顯著相關(guān)(HR=1.73,95%CI1.09～2.75，P=0.02；HR=2.34,95%CI1.21～4.52，P=0.01；HR=4.44,95%CI1.61～12.26，P<0.001)，即年齡越大、TNM分期越高、風(fēng)險(xiǎn)評分越高，患者的3年和5年生存率越低。依據(jù)上述預(yù)測因素構(gòu)建列線圖，見圖6。應(yīng)用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)，該列線圖預(yù)測肺鱗癌患者3年和5年生存率的準(zhǔn)確性較高，見圖7。時(shí)間依賴性ROC曲線驗(yàn)證模型3年和5年生存率的曲線下面積分別為0.57、0.58，見圖8。

圖4 LASSO回歸模型的調(diào)整參數(shù)繪制cifit對象

圖5 高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組肺鱗癌患者的生存曲線比較

圖6 預(yù)測肺鱗癌患者3年、5年生存率的列線圖

圖7 列線圖預(yù)測肺鱗癌患者3年(7a)和5年(7b)生存率的校準(zhǔn)曲線(黑色虛線代表理想預(yù)測模型，紅色實(shí)線代表實(shí)際觀測模型)

注：ROC為受試者工作特征曲線

3 討 論

目前仍缺乏特異、靈敏的預(yù)測肺鱗癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。肺鱗癌患者的預(yù)后模型已有報(bào)道[10]。有研究表明，與腫瘤抑制蛋白TP53相關(guān)的標(biāo)志物組織激肽釋放酶6和酪蛋白基因S1是肺鱗癌患者特異和獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物，可有效地預(yù)測免疫治療和化療的肺鱗癌患者預(yù)后[11]。在腫瘤細(xì)胞中，基因組和表觀基因組的改變可以進(jìn)行檢測，且已被證實(shí)與某些腫瘤特征(如致癌轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖)有關(guān)[12]。

甲基化改變在腫瘤中較常見。在這些調(diào)控的DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因中，有一些甲基化驅(qū)動(dòng)基因可能通過癌基因的過表達(dá)或腫瘤抑制基因的敲除而促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，重新平衡腫瘤的微環(huán)境，甲基化驅(qū)動(dòng)基因可能成為肺鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[13-14]。隨著甲基化測序技術(shù)的發(fā)展，表觀遺傳變化易于檢測，測序深度和相應(yīng)的準(zhǔn)確性均較高。因此，本研究采用R軟件包(MethylMix)來識別具有異常甲基化的DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因，并將這些數(shù)據(jù)與基因表達(dá)RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)系起來。這種綜合分析已在胃癌的研究中進(jìn)行了驗(yàn)證[9]。本研究通過以上研究方法在TCGA肺鱗癌甲基化和表達(dá)數(shù)據(jù)中進(jìn)行初步的篩選，得到45個(gè)DNA甲基化驅(qū)動(dòng)的基因主要富集在與基因表達(dá)相關(guān)的信號通路，如絲氨酸家族氨基酸代謝過程、細(xì)胞和細(xì)胞間黏附連接、細(xì)胞和細(xì)胞間連接，表明肺鱗癌的甲基化變化調(diào)節(jié)基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在此風(fēng)險(xiǎn)模型中，ABCC5、CLDN1和CSTA基因的表達(dá)水平升高，它們可能是典型的腫瘤抑制基因，低甲基化預(yù)示著預(yù)后良好。癌基因中甲基化水平下調(diào)和腫瘤抑制基因中甲基化水平上調(diào)可以同時(shí)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15]。例如，ABCC5是一種ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中過表達(dá)，同時(shí)也在具有高骨轉(zhuǎn)移潛能的人和小鼠乳腺癌細(xì)胞系中顯著上調(diào)，穩(wěn)定的ABCC5基因敲除可顯著降低小鼠的骨轉(zhuǎn)移和溶骨性骨破壞；ABCC5在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起中介作用；ABCC5在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)對破骨細(xì)胞介導(dǎo)的有效骨吸收具有重要作用[16]。緊密連接是細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的黏附，對維持正常上皮細(xì)胞屏障的通透性和完整性起重要作用。CLDN1編碼的蛋白是一種完整的膜蛋白，是緊密連接鏈的組成部分，其已被證實(shí)對多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移有調(diào)節(jié)作用，研究發(fā)現(xiàn)CLDN1在食管鱗癌組織和細(xì)胞系中異常增加，且主要分布于細(xì)胞核，CLDN1在體外和體內(nèi)均通過觸發(fā)自噬來促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，CLDN1通過上調(diào)UNC-51類自噬激活激酶1的表達(dá)來誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的自噬[13，17]。有研究表明，與健康志愿者相比，胰腺導(dǎo)管腺癌患者的CSTA及CSTA mRNA表達(dá)水平升高，且與胰腺導(dǎo)管腺癌臨床分期相關(guān)，在部分腫瘤組織和多種腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞中檢測到CSTA表達(dá)[18]。此外，考慮到成本效益，本研究基于特定基因的簽名容易進(jìn)行常規(guī)檢測，由3個(gè)DNA甲基化驅(qū)動(dòng)的差異性基因組成的風(fēng)險(xiǎn)評分建立預(yù)測模型，該模型與其他臨床因素相結(jié)合可以產(chǎn)生對肺鱗癌患者預(yù)后進(jìn)行評分的列線圖。本研究結(jié)果支持由DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因可能與腫瘤預(yù)后相關(guān)的假設(shè)。表明檢測3個(gè)DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)水平是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，且可以預(yù)測肺鱗癌患者的生存時(shí)間。但本研究也存在不足之處，如未在臨床進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。為了檢測肺鱗癌的結(jié)果，有學(xué)者建議增加對肺鱗癌患者臨床生物標(biāo)志物的研究，如mRNA片段標(biāo)志物、環(huán)狀RNA的RNA-seq分析[19]和長鏈非編碼RNA生物標(biāo)志物[20]。此外，雖然本研究列線圖結(jié)合了年齡、TNM分期和風(fēng)險(xiǎn)水平來預(yù)測肺鱗癌患者的預(yù)后，但由于研究隊(duì)列中的信息有限，臨床特征尚不全面。未來有必要從各臨床中心增加更多具有完整臨床信息和序列的數(shù)據(jù)，從而構(gòu)建預(yù)測效能更佳的列線圖。

綜上所述，ABCC5、CLDN1和CSTA的改變與肺鱗癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。本研究建立了一個(gè)結(jié)合年齡、TNM分期和風(fēng)險(xiǎn)水平的列線圖，在臨床實(shí)踐中具有較高的成本效益，可對肺鱗癌患者預(yù)后進(jìn)行個(gè)體化預(yù)測，具有較高的敏感性和特異性。