陳培劍，丁明璐，蘇然宇，張雪嬌，李魯新，劉潔婷，馮彪，初彥輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病由一組復(fù)雜的疾病過(guò)程引起，是遺傳和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)代謝性疾病，其特征是由胰島素產(chǎn)生不足(Ⅰ型)或受體細(xì)胞對(duì)胰島素反應(yīng)不良(Ⅱ型)而導(dǎo)致的長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)。國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)數(shù)據(jù)顯示，全球18～99歲人群的糖尿病患病人數(shù)達(dá)4.51億，預(yù)計(jì)2045年將增至6.93 億[1]。目前，糖尿病的確切病因仍未完全闡明。研究表明，糖尿病發(fā)病的潛在機(jī)制復(fù)雜，可能涉及器官和基因表達(dá)水平的變化[2-3]。糖尿病可導(dǎo)致許多并發(fā)癥，其急性代謝并發(fā)癥包括血糖水平異常升高導(dǎo)致的糖尿病酮癥酸中毒(高血糖癥)和低血糖導(dǎo)致的昏迷(低血糖癥)[4-7]；其慢性并發(fā)癥主要以微血管病變?yōu)橹鳎缣悄虿∫暰W(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，此外，還包括大血管病變，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)、腦卒中等。目前的糖尿病治療手段只能延緩疾病發(fā)展[8]。人類(lèi)細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)在某種程度上受到一種或多種微RNA(microRNA，miRNA/miR)的調(diào)節(jié)。近年的miRbase版本統(tǒng)計(jì)了2 654個(gè)人類(lèi)成熟miRNA的序列[9-10]，其中許多miRNA功能尚未被定義。在基因調(diào)控中，各種物種間miRNA的廣泛分布起關(guān)鍵作用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將有越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了約1/3人體基因的調(diào)控[11-12]。不同miRNA表達(dá)的差異在疾病發(fā)生發(fā)展及調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miR-200b失調(diào)與多種疾病有關(guān)，如癌癥、代謝疾病[13]?，F(xiàn)就miR-200b在糖尿病并發(fā)癥中的作用進(jìn)行綜述。

1 miR-200b概述

miRNA通過(guò)與其靶基因序列配對(duì)發(fā)揮作用，多數(shù)由編碼或非編碼轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)含子區(qū)域編碼，少數(shù)由外顯子區(qū)域編碼。RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄miRNA基因。長(zhǎng)的一級(jí)序列在5′端加帽結(jié)構(gòu)，在3′端被多聚腺苷酸化，衍生的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miRNA前體(pri-miRNA)被復(fù)合體識(shí)別，該復(fù)合體由核蛋白DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域8和核糖核酸酶Ⅲ組成。核成熟釋放的一種前體miRNA稱(chēng)為核酸前體，其通過(guò)核輸出蛋白-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。pre-miRNA被切割后產(chǎn)生約22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA，與Ago蛋白質(zhì)家族中的Ago2形成一個(gè)大的核糖核蛋白效應(yīng)物復(fù)合物，稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，其與Ago2的結(jié)合有利于鏈的穩(wěn)定，過(guò)客鏈可被降解，以產(chǎn)生成熟的RISC或作為另一種功能性miRNA[14]。

miR-200b是miR-200家族成員，根據(jù)其序列中單個(gè)核苷酸的差異分為兩個(gè)亞類(lèi)，miR-141和miR-200a以及miR-200b、miR-200c和miR-429。在人體中，miR-200家族通過(guò)第1號(hào)、第12號(hào)染色體轉(zhuǎn)錄而來(lái)，miR-200b、miR-200a、miR-429來(lái)自第1號(hào)染色體，miR-200c、miR-141來(lái)自第12號(hào)染色體。成熟的miR-200b來(lái)自miR-200b前體S的3′臂上，在機(jī)體中表達(dá)較為保守[15]。在不同染色體上，miR-200家族成員的基因存在顯著差異，但其基因調(diào)控存在高度重疊。miR-200b在多種細(xì)胞中表達(dá)，包括卵巢癌細(xì)胞、乳腺干細(xì)胞、腎系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和血管生成等[16-19]。miR-200b在糖尿病發(fā)病中起重要作用，不同類(lèi)型糖尿病并發(fā)癥中的miR-200b表達(dá)亦不同。miR-200b通過(guò)作用于不同靶點(diǎn)影響不同的信號(hào)途徑，進(jìn)而影響機(jī)體對(duì)一些疾病的表達(dá)調(diào)控，被認(rèn)為是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的基本調(diào)節(jié)因子之一。

2 miR-200b與糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系

miRNA與糖尿病并發(fā)癥存在密切聯(lián)系。血液中miRNA的水平可能預(yù)示著疾病的發(fā)作，特定miRNA表達(dá)與不同病理生理狀態(tài)有關(guān)，包括糖尿病及其并發(fā)癥。有證據(jù)表明，miRNA可調(diào)節(jié)胰島素作用和葡萄糖代謝[20]。例如，空腹血糖受損和2型糖尿病個(gè)體的miR-126表達(dá)均顯著降低[21]。有研究檢測(cè)糖尿病前期和新診斷2型糖尿病受試者miRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-1249、miR-320b和miR-527可能是2型糖尿病易感性的生物標(biāo)志物[22]，miRNA可調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的功能，其可能是糖尿病的潛在治療靶點(diǎn)[23]，敲除miR-375小鼠的胰島β細(xì)胞質(zhì)量和葡萄糖刺激胰島素分泌減少，表現(xiàn)為高血糖癥，表明miR-375可能是胰島β細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑[24]。此外，Kloosterman等[25]報(bào)道，miR-375在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞增殖形成胰島細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。miRNA水平的變化在腎纖維化、視力喪失和下肢缺血等長(zhǎng)期糖尿病所致并發(fā)癥的發(fā)展中起作用[26-27]，見(jiàn)表1。

表1 miR-200b介導(dǎo)的靶點(diǎn)在糖尿病并發(fā)癥中的作用

續(xù)表1

2.1miR-200b與DCM 歐洲心臟學(xué)會(huì)指出，DCM最廣泛的定義是“在沒(méi)有其他心血管疾病的情況下發(fā)生的心肌功能障礙”，但由于糖尿病通常與高血壓或缺血性心臟病等其他心血管疾病并存，該定義似乎不切實(shí)際。有學(xué)者主張將DCM沒(méi)有任何高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、瓣膜疾病或局部缺血癥狀，但出現(xiàn)心力衰竭的心肌疾病歸因于糖尿病[39-40]。DCM在結(jié)構(gòu)水平上表現(xiàn)為左心室增大、心臟纖維化增加、舒張功能和收縮功能均受損[41]。心肌細(xì)胞局部纖維化是DCM結(jié)構(gòu)改變的重要標(biāo)志，也是糖尿病患者發(fā)生心源性猝死的主要原因，其特征為舒張期順應(yīng)性下降和心臟收縮不良，雖然屬于心肌疾病，但其機(jī)制與高血壓和冠狀動(dòng)脈性疾病不同[42]。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷是高血糖最初引發(fā)的病理生理變化，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成與沉積在糖尿病并發(fā)癥發(fā)展中起主要作用。持續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致纖維化疾病中血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)，這種間充質(zhì)轉(zhuǎn)化類(lèi)似于癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。EndMT是心肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵來(lái)源之一，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的增加，如CD31、血管內(nèi)皮鈣黏素表達(dá)缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加。有研究通過(guò)比較鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠、特異性miR-200b轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠、空轉(zhuǎn)陰性對(duì)照小鼠的心臟組織和心臟內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠存在EndMT的變化，但特異性miR-200b轉(zhuǎn)基因小鼠的EndMT變化被阻止，糖尿病小鼠心臟組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白等特異性標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-200b后，EndMT進(jìn)程被抑制。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b介導(dǎo)DCM中的EndMT，miR-200b的過(guò)表達(dá)也可防止糖尿病引起的心臟功能和結(jié)構(gòu)的改變[28]。

miR-200b與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ途徑相關(guān)，與靶向CD36的miRNA之間存在重疊，DCM組織和心肌細(xì)胞中miR-200b顯著下調(diào)，而CD36過(guò)表達(dá)，且CD36的沉默可以抑制通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ途徑的DCM的心肌細(xì)胞凋亡。Xu等[29]發(fā)現(xiàn)，正常大鼠與糖尿病大鼠心臟中的64個(gè)基因存在差異表達(dá)，同時(shí)鑒定出29個(gè)差異表達(dá)的miRNA，且CD36與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ信號(hào)通路基因集之間存在重疊；miR-200b以CD36為靶點(diǎn)，通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ信號(hào)通路調(diào)控DCM的心肌細(xì)胞凋亡。

2.2miR-200b與DR DR是導(dǎo)致成年人失明的首位原因，DR既往被認(rèn)為是糖尿病的微血管并發(fā)癥，但近年的研究表明，神經(jīng)變性是DR發(fā)病過(guò)程中的早期事件[43]，也是糖尿病比較常見(jiàn)且較嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥。DR的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，許多因素會(huì)導(dǎo)致DR，其表現(xiàn)為氧化應(yīng)激增加以及視網(wǎng)膜和毛細(xì)血管細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)受損等，使血管通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增生和水腫及視網(wǎng)膜血管病理性增生，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的進(jìn)行性病變。目前DR的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[44]。近年來(lái)，隨著miRNA在視網(wǎng)膜疾病中研究的不斷深入，miRNA與視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)性逐漸被揭示。Kovacs等[45]采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立1型糖尿病大鼠模型，在其視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中分別檢出了350種和220種miRNA，其與正常小鼠的120種視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞miRNA存在差異表達(dá)。

Chen等[46]發(fā)現(xiàn)，DR和葡萄糖暴露內(nèi)皮細(xì)胞中的p300增加。高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生增加是糖尿病內(nèi)皮功能障礙的特征之一，EndMT是其中的重要機(jī)制，此現(xiàn)象已在DCM中被證明。Cao等[31]研究發(fā)現(xiàn)，EndMT與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相似，TGF-β是EndMT的關(guān)鍵因子，在Smad依賴(lài)的途徑中，TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)Smad、促分裂原活化的蛋白激酶激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和p38/促分裂原活化的蛋白激酶的激活介導(dǎo)EndMT，促使糖尿病視網(wǎng)膜發(fā)生EndMT。

miR-200b是DR和糖尿病小鼠中最早發(fā)現(xiàn)失調(diào)的miRNA之一，miR-200b可以保護(hù)血管通透性并防止血管異常生成。在糖尿病中，miR-200b表達(dá)下調(diào)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)顯著上調(diào)，視網(wǎng)膜血管生成和新血管形成增加。miR-200b表達(dá)亦受到多梳抑制性復(fù)合物2的調(diào)節(jié)[32]。VEGFA是一種促血管生成因子，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、遷移和增殖以及增強(qiáng)血管滲透性等方面發(fā)揮作用[47]。除VEGFA外，VEGF家族其他成員還包括VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子[48]。VEGF是人血管生長(zhǎng)中不可缺少的物質(zhì)，尤其是涉及血管和器官重塑的疾病，如傷口愈合、DR[49]。McArthur等[30]報(bào)道，在高糖環(huán)境下，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和內(nèi)皮細(xì)胞中miR-200b表達(dá)下調(diào)；該研究對(duì)DR患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)VEGF基因表達(dá)增加，但高血糖誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不清楚。Li等[33]的研究顯示，miR-200b通過(guò)下調(diào)靶基因VEGFA緩解DR的發(fā)展，VEGFA是促進(jìn)腫瘤血管擴(kuò)張的主要因素，在早期和晚期DR中具有重要意義。

Han等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)在DR小鼠的視網(wǎng)膜組織中高表達(dá)，沉默YAP1可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，YAP1通過(guò)調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1的表達(dá)發(fā)揮作用；且熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1與miR-200b的相互作用為YAP1沉默通過(guò)長(zhǎng)鏈非編碼RNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1/miR-200b-3p/VEGFA軸減輕DR的發(fā)展提供了依據(jù)。對(duì)Akita小鼠(一種1型糖尿病的遺傳模型)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b調(diào)節(jié)的抗氧化基因1可能在DR中具有保護(hù)作用[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，羅通配方對(duì)大鼠DR具有保護(hù)作用，羅通湯源于抵當(dāng)湯(黃芪、丹參、三七、訶子、大黃以15∶10∶3∶2∶1的比例進(jìn)行煎煮)，羅通配方可明顯緩解糖尿病大鼠的組織學(xué)異常，且不受血糖水平影響，并可改善血液流變學(xué)指標(biāo)；與未治療糖尿病大鼠相比，使用羅通配方的糖尿病大鼠體內(nèi)VEGF/VEGF受體和血視網(wǎng)膜屏障的表達(dá)降低，色素上皮衍生因子和緊密連接蛋白1/Occludin顯著增加，視網(wǎng)膜miR-200b表達(dá)升高[50]。研究表明，miR-200b/c通過(guò)抑制血管形成抑制素-2對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用。抑制血管新生可能是治療視網(wǎng)膜血管疾病的潛在治療策略[36]，這為治療DR提供了更多的理論依據(jù)和研究方向。

2.3miR-200b與DN DN是糖尿病中較常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥，是終末期腎病的常見(jiàn)原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，約40%的糖尿病患者合并DN[51-52]。DN的特征是蛋白尿(尿白蛋白與肌酐比值≥30 mg/g)和腎小球?yàn)V過(guò)率下降，其主要病理特征為腎小球增大、腎小球基膜增厚、系膜細(xì)胞增生、腎小管間質(zhì)擴(kuò)張、細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原、纖連蛋白)異常積聚[53]。DN發(fā)生分為多個(gè)階段，腎小球超濾后的腎功能持續(xù)下降通常發(fā)生在糖尿病發(fā)病后15～20年，并最終發(fā)展為腎小球硬化和腎纖維化[54-55]。目前，DN的分子機(jī)制仍不清楚，其治療策略是針對(duì)血糖和高血壓的基本失調(diào)，可延緩疾病發(fā)展。

DN涉及多種信號(hào)通路，其中PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路與腎纖維化密切相關(guān)[56-57]，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以磷酸化Smad3，促進(jìn)系膜細(xì)胞膠原纖維發(fā)育，增加腎纖維化的程度[58]。miR-200b表達(dá)增加激活下游PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致腎小球肥大和纖維化。Wu等[59]研究發(fā)現(xiàn)，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因是miR-200b的靶基因，其可將磷脂酰肌醇三磷酸酯去磷酸化為磷脂酰肌醇二磷酸酯，從而拮抗 PI3K的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)PI3K/Akt通路的負(fù)調(diào)節(jié)。Yu等[37]研究證明，miR-200b可靶向人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，通過(guò)PI3K/Akt通路激活腎臟的纖維化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)金雞菊醇提取物可以改善DN。腎小球肥大是DN的標(biāo)志。TGF-β1激活的Akt激酶在腎小球系膜肥大中起重要作用。然而，TGF-β激活A(yù)kt的機(jī)制尚不完全清楚。Kato等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的DN相關(guān)的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和Akt的激活由miR-200b/c增加導(dǎo)致的GATA結(jié)合蛋白2伴侶蛋白下調(diào)引起，這可能是導(dǎo)致DN進(jìn)展中腎小球系膜肥大的新機(jī)制。

在DN發(fā)展過(guò)程中，腎細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)的增加促進(jìn)了腎臟纖維化和肥大。TGF-β1啟動(dòng)子受E-box、上游刺激因子的正調(diào)控。在小鼠系膜細(xì)胞中，miR-200b/c上調(diào)TGF-β1水平。1型(鏈脲佐菌素)和2型(db/db)糖尿病小鼠的腎小球以及經(jīng)體外TGF-β1處理小鼠的腎小球系膜細(xì)胞中miR-200b/c水平升高，表明TGF-β1能夠自我調(diào)節(jié)；且miRNA調(diào)控通路可能通過(guò)放大TGF-β1信號(hào)加快腎臟慢性纖維化的進(jìn)程，如DN。

3 小 結(jié)

miR-200b在糖尿病并發(fā)癥(如心血管并發(fā)癥、微血管并發(fā)癥、DR、DN)中發(fā)揮重要作用。在DCM中，miR-200b可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，并介導(dǎo)CD36激活DCM中的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ信號(hào)通路，導(dǎo)致DCM發(fā)生，此外，miR-200b還可通過(guò)調(diào)節(jié)一些上下游靶點(diǎn)影響DR的發(fā)生發(fā)展，故可將miR-200b作為糖尿病的治療靶點(diǎn)。目前，不同組織器官中miR-200b的機(jī)制可能具有不同的特點(diǎn)，其在糖尿病并發(fā)癥進(jìn)展中的作用尚未闡明。因此，探索miR-200b在糖尿病并發(fā)癥中的作用機(jī)制有助于研發(fā)更高效的抗糖尿病并發(fā)癥藥物，未來(lái)miR-200b可能成為糖尿病及其并發(fā)癥診治的新靶點(diǎn)。