喬 磊，邸振宇，喬 曼，吳敬峰，及 超，杜鑫沖

(1.保定市第二醫(yī)院骨二科，河北 保定 071000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075000)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，特征是關(guān)節(jié)軟骨的退化、喪失以及滑膜炎癥，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、腫脹、疼痛和活動(dòng)能力喪失[1]。骨關(guān)節(jié)炎目前的治療方式主要為非手術(shù)治療，如運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)和藥物治療[2]。目前，用于治療骨關(guān)節(jié)炎的大多數(shù)藥物是非甾體抗炎藥，但由于不可避免的副作用，非甾體抗炎藥的使用受到很大限制[3]。因此，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎有必要進(jìn)一步探索新的治療藥物以開發(fā)更有效的治療策略。

紫丁香苷是一種提取自五加科和木犀科根莖的酚苷類化合物，具有抗高血糖、抗抑郁、抗氧化和抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性[4]。多種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥材和中藥復(fù)方中均含有紫丁香苷[5-7]，但紫丁香苷治療骨關(guān)節(jié)炎的具體作用機(jī)制目前尚不清楚。有研究認(rèn)為，激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理過程，其表達(dá)水平在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，可促使軟骨細(xì)胞發(fā)揮正常功能[8]。本研究通過構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討紫丁香苷對(duì)前交叉韌帶橫斷(anterior cruciate ligament transection，ACLT)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎病理?yè)p傷、炎癥反應(yīng)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，以期為臨床防治骨關(guān)節(jié)炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及主要試劑

72只雄性SD大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái)，6周齡，體質(zhì)量(190±10)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2020-001，飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)室。

紫丁香苷(11539)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雙醋瑞因膠囊(J20150097)購(gòu)自昆明積大制藥股份有限公司；蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(G1120-100)、番紅O-固綠軟骨染色液(G1371)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IL-6(ZN2272-PIU)、TNF-α(ARB13318)和IL-1β(ARB10508)ELISA試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；一抗MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

參照段荔等[9]的方法制作骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、雙醋瑞因組、紫丁香苷25 mg/kg組、紫丁香苷50 mg/kg組和紫丁香苷100 mg/kg組，每組12只。所有大鼠麻醉后于右肢踝骨前內(nèi)側(cè)髕骨旁依次切開皮膚、筋膜和關(guān)節(jié)囊，除假手術(shù)組外其余各組大鼠均暴露并切斷前交叉韌帶，行抽屜試驗(yàn)檢測(cè)前交叉韌帶是否斷裂成功，斷裂成功后用生理鹽水進(jìn)行清洗，復(fù)位髕骨，依次縫合關(guān)節(jié)囊、皮膚等。紫丁香苷25 mg/kg組、紫丁香苷50 mg/kg組、紫丁香苷100 mg/kg組每日分別腹腔注射紫丁香苷25、50、100 mg/kg[10]，雙醋瑞因組每日以雙醋瑞因54 mg/kg灌胃[11]，假手術(shù)組和模型組每日以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d。

1.3 取材

所有大鼠第28天灌胃后禁食12 h，取股動(dòng)脈血約3 mL置于5 mL肝素鈉抗凝管中，4 ℃保存待用。處死所有大鼠并解剖全膝關(guān)節(jié)，于髕上囊剪開約0.5 cm的切口，用1 mL生理鹽水分3次灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)灌洗液置于硅化試管中。4 ℃下4 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃低溫冰凍保存待用。將膝關(guān)節(jié)用4%福爾馬林固定，5%甲酸脫鈣，1周后取出，沿關(guān)節(jié)冠狀面切取軟骨。

1.4 HE染色

將各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于4%多聚甲醛中固定72 h后，用20%乙二胺四乙酸進(jìn)行脫鈣處理，再將其置于梯度乙醇中脫水，隨后在石蠟中包埋。將石蠟包埋的組織切成厚度為5 μm的切片，于室溫下進(jìn)行蘇木精染色4～10 min，隨后伊紅染色0.5～2 min。光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。采用Mankin’s法[12]進(jìn)行關(guān)節(jié)病理?yè)p傷評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0～1分為軟骨正常，2～5分為軟骨輕度損傷，6～9分為軟骨中度損傷，10～14分為軟骨重度損傷。

1.5 番紅O-固綠染色

將大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片脫蠟至水，加入新鮮配制的Weigert染液染色5 min，水洗，酸性分化液分化15 s，隨后蒸餾水洗滌10 min，置入固綠染色液中染色5 min，用弱酸溶液洗滌15 s去除固綠，置入番紅O染色液內(nèi)染色5 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，光學(xué)樹脂封固。于熒光顯微鏡下觀察。采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)半定量評(píng)分[13]評(píng)估骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)(0～8分)、軟骨基質(zhì)著色(0～6分)、軟骨細(xì)胞分布及數(shù)量(0～3分)、潮線是否完整(0～1分)及有無骨贅形成(0～3分)，評(píng)分越高提示骨關(guān)節(jié)炎越嚴(yán)重。

1.6 ELISA

取1.3方法中收集的各組大鼠股動(dòng)脈血，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并取1.3方法中關(guān)節(jié)灌洗液，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)灌洗液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.7 Western blot

在各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。4 ℃下加入MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，采用ImageJ V1.8.0.112軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白與GAPDH比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織病理?yè)p傷程度

假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨組織相對(duì)保持完整，可見保存完好的光滑軟骨表面和軟骨細(xì)胞，軟骨組織正常排列，結(jié)構(gòu)層次清晰，潮線完整。模型組和紫丁香苷25 mg/kg組出現(xiàn)嚴(yán)重和廣泛的軟骨破壞，關(guān)節(jié)軟骨層狀結(jié)構(gòu)消失，軟骨表面細(xì)胞破損嚴(yán)重且排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管增生，4層結(jié)構(gòu)不易分辨，潮線不完整，出現(xiàn)明顯的骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織病理?yè)p傷。雙醋瑞因組、紫丁香苷50 mg/kg組和紫丁香苷100 mg/kg組病理?yè)p傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、排列不規(guī)則、毛細(xì)血管增生均有不同程度的改善，番紅O-固綠染色呈重度減退，潮線斷續(xù)或多重潮線，可分辨4層結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞增殖，軟骨已有不同程度的恢復(fù)，見圖1、2。

a：假手術(shù)組；b：模型組；c：雙醋瑞因組；d：紫丁香苷25 mg/kg組；e：紫丁香苷50 mg/kg組；f：紫丁香苷100 mg/kg組

a:假手術(shù)組；b：模型組；c：雙醋瑞因組；d：紫丁香苷25 mg/kg組；e：紫丁香苷50 mg/kg組；f：紫丁香苷100 mg/kg組

2.2 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠Mankin’s評(píng)分和OARSI評(píng)分

與假手術(shù)組比較，模型組Mankin’s評(píng)分、OARSI評(píng)分均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，紫丁香苷25 mg/kg組Mankin’s評(píng)分、OARSI評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，雙醋瑞因組、紫丁香苷50 mg/kg組和紫丁香苷100 mg/kg組Mankin’s評(píng)分、OARSI評(píng)分均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠Mankin’s評(píng)分和OARSI評(píng)分分)

2.3 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清和關(guān)節(jié)灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平

與假手術(shù)組比較，模型組血清和關(guān)節(jié)灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，紫丁香苷25 mg/kg組血清和關(guān)節(jié)灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雙醋瑞因組、紫丁香苷50 mg/kg組和紫丁香苷100 mg/kg組血清和關(guān)節(jié)灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清和關(guān)節(jié)灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平

2.4 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組MMP-13、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平均較高，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表達(dá)水平均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，紫丁香苷25 mg/kg組MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，雙醋瑞因組、紫丁香苷50 mg/kg組和紫丁香苷100 mg/kg組MMP-13、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平均較低，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表達(dá)水平均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、圖4、表3。

a：假手術(shù)組；b：模型組；c：雙醋瑞因組；d：紫丁香苷25 mg/kg組；e：紫丁香苷50 mg/kg組；f：紫丁香苷100 mg/kg組

a：假手術(shù)組；b：模型組；c：雙醋瑞因組；d：紫丁香苷25 mg/kg組；e：紫丁香苷50 mg/kg組；f：紫丁香苷100 mg/kg組

表3 骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠MMP-13、Aggrecan、type Ⅱ collagen、Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見病癥，雖然手術(shù)治療發(fā)展迅速，但藥物治療仍較常用，然而目前的藥物仍存在一定的副作用。骨關(guān)節(jié)炎目前尚無可用的預(yù)防或治療性生物學(xué)干預(yù)措施，相關(guān)的藥物制劑還處于探索階段。目前廣泛認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨的退變是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的關(guān)鍵[14]，Mankin’s評(píng)分和OARSI評(píng)分可用于評(píng)價(jià)大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)的退變程度。本研究HE染色和番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，紫丁香苷可改善骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨組織損傷，并降低大鼠Mankin’s評(píng)分、OARSI評(píng)分，提示紫丁香苷對(duì)軟骨損傷具有保護(hù)作用。

骨關(guān)節(jié)炎是滑膜關(guān)節(jié)常見的慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)會(huì)促進(jìn)滑膜中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的過度表達(dá)，誘導(dǎo)新生血管、炎癥以及基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨降解[15]。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可通過逆轉(zhuǎn)炎癥因子IL-1β，IL-6、TNF-α等的上調(diào)緩解ACLT誘導(dǎo)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎癥狀。Ma等[17]研究發(fā)現(xiàn)葛根素可通過抑制ACLT大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。本研究ELISA實(shí)驗(yàn)表明，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠經(jīng)紫丁香苷作用后，血清和關(guān)節(jié)灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，提示紫丁香苷可通過抑制炎癥因子的釋放延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨組織起保護(hù)作用。

有研究表明，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)含量的高低對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的病情變化有明顯的影響[18]。MMP-13是目前最有效的Ⅱ型膠原纖維降解酶，能夠降解軟骨基質(zhì)中的type Ⅱ collagen，在骨關(guān)節(jié)炎中明顯高表達(dá)[19]。關(guān)節(jié)軟骨由高分化軟骨和細(xì)胞外基質(zhì)組成，而細(xì)胞外基質(zhì)主要由Aggrecan和type Ⅱ collagen組成，二者共同維持軟骨的生物力學(xué)性能[20]。Aggrecan和type Ⅱ collagen的減少是細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要原因，會(huì)導(dǎo)致軟骨骨架結(jié)構(gòu)受到破壞。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)表明，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠經(jīng)紫丁香苷作用后，MMP-13蛋白表達(dá)水平降低，Aggrecan、type Ⅱ collagen蛋白表達(dá)水平升高，提示紫丁香苷可通過抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解改善骨關(guān)節(jié)炎。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化產(chǎn)生蛋白酶而參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，其在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中呈過度激活狀態(tài)[21]。中醫(yī)藥干預(yù)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可通過下調(diào)Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖或抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[22]。Zhong等[23]研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。Ding等[24]研究發(fā)現(xiàn)大黃素干預(yù)可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來防止骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨退變并延緩疾病進(jìn)展。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)表明，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠經(jīng)紫丁香苷作用后，Wnt1、β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，提示紫丁香苷可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織起保護(hù)作用。

綜上所述，紫丁香苷可通過抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化改善ACLT誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織病理?yè)p傷，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織起保護(hù)作用。