楊娜,潘鵬濤,董旭,范培月,吳航利,王佳,雷忻*

苯并芘脅迫對(duì)泥鰍外周血紅細(xì)胞及抗氧化酶活性的影響

楊娜1,2,潘鵬濤1,2,董旭1,2,范培月1,2,吳航利1,2,王佳1,2,雷忻1,2*

1. 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 延安 716000 2. 延安市生態(tài)恢復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 延安 716000

為研究苯并芘對(duì)魚類外周血紅細(xì)胞及抗氧化酶系的影響，本文以泥鰍作為研究對(duì)象，將其暴露于0、5、10、15 μg/LBaP溶液中20 d，分別在5、10、15、20 d時(shí)取樣，采用血涂片微核測(cè)定法觀察紅細(xì)胞微核與核異常，采用鄰苯三酚自氧化法和鉬酸銨比色法分別檢測(cè)肝臟超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性。結(jié)果表明，隨著BaP濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，泥鰍血紅細(xì)胞微核率顯著升高；隨著BaP濃度的升高，泥鰍SOD、CAT活性在20 d的暴露期內(nèi)呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。因此，BaP脅迫會(huì)對(duì)泥鰍產(chǎn)生一定的遺傳毒性和氧化毒性效應(yīng)，且毒性作用具有時(shí)間-劑量效應(yīng)。

苯并芘; 泥鰍; 血紅細(xì)胞; 抗氧化酶

苯并芘（Benzopyrene，BaP），作為一種典型的多環(huán)芳烴化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs），廣泛分布于水生生態(tài)系統(tǒng)，以其強(qiáng)致癌、致畸、難降解的特性對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用，造成環(huán)境污染、生物多樣性下降[1,2]。近年來(lái)大量研究顯示，淡水、海水水體及其沉積物中存在較高含量BaP，對(duì)生物體和周圍環(huán)境造成極大影響[3,4]。例如，何躍華等研究發(fā)現(xiàn)，BaP濃度升高可對(duì)海洋生物貽貝造成組織器官氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和DNA鏈斷裂，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系[5]；陳劍杰等通過(guò)檢測(cè)BaP脅迫下鯉魚肝、腎組織中抗氧化以及非特異性免疫能力發(fā)現(xiàn)，隨著苯并芘暴露濃度的升高，鯉魚肝臟、腎臟中SOD、CAT、GSH活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)鯉魚組織結(jié)構(gòu)造成損傷[6]。隨著陜北地區(qū)能源化工基地建設(shè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，延河流域多環(huán)芳烴類化合物污染有加劇的趨勢(shì)，其對(duì)水生生物的生理生態(tài)毒性研究更為迫切。

魚類作為水體污染物通過(guò)食物鏈從自然環(huán)境向人體遷移的重要載體，是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能直接或間接地反映水生生態(tài)系統(tǒng)的污染情況[7,8]。泥鰍（），隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、泥鰍屬()，是一類小型硬骨淡水魚，在我國(guó)分布廣泛，且其鉆泥性強(qiáng)、易在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)、對(duì)污染物較為敏感，故適宜作為實(shí)驗(yàn)材料[9,10]。本研究以泥鰍為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)不同濃度梯度的BaP對(duì)泥鰍外周血紅細(xì)胞微核誘導(dǎo)作用以及肝臟超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶活性（Catalase，CAT）的影響，為了解BaP對(duì)魚類的遺傳毒性和氧化毒性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用泥鰍平均體重在(10±2.3) g，平均體長(zhǎng)在(10.5±2.1) cm。購(gòu)自陜西省延安市水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖基地。在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)14 d，使用自然晾曬96 h的脫氯自來(lái)水，期間喂食少量面包碎屑。挑取體格強(qiáng)健活躍的泥鰍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取樣的前一天停止投食。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

配制3組不同質(zhì)量濃度苯并芘溶液：5（低濃度組）、10（中濃度組）、15（高濃度組）μg/L以及溶劑對(duì)照組。各濃度組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)組，使用丙酮助溶，配制不同濃度梯度的BaP溶液，每只桶里放置12尾泥鰍。試驗(yàn)期間，每間隔24 h更換1次藥物，以保證溶液吸收的氧氣含量、酸堿度、溫度和其它理化性質(zhì)的穩(wěn)定。換藥后隔天喂食少量飼料或者面包屑，取樣前一天不予喂食。實(shí)驗(yàn)期間每天對(duì)泥鰍進(jìn)行觀察，察看其體色和行為、能力變化，并及時(shí)將死亡個(gè)體撈出。

1.3 紅細(xì)胞微核測(cè)定

分別在BaP溶液中5 d、10 d、15 d和20 d時(shí)取出泥鰍，進(jìn)行斷尾取血，制作血涂片，瑞氏-吉姆薩染液染色，用DM6B徠卡正置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，每張片子統(tǒng)計(jì)3000個(gè)外周血細(xì)胞。采集核異常、微核圖像并計(jì)算微核率。

1.4 肝臟抗氧化酶測(cè)定

分別取BaP溶液暴露5 d、10 d、15 d和20 d的泥鰍，快速處死，剖取肝臟，液氮研磨后按比例加入生理鹽水、離心取上清液，保存在4 ℃冰箱。

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性，用紫外分光光度計(jì)（UV-2600紫外分光光度計(jì)，日本津島）在波長(zhǎng)320 nm下讀取OD值。鉬酸銨比色法測(cè)定CAT活性，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)405 nm下讀取OD值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理以平均數(shù)（MEAN）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，采用SPSS20.0進(jìn)行方差分析（主要是LSD最小顯著差數(shù)法和Duncun多重比較），根據(jù)分析結(jié)果用Origin繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaP對(duì)泥鰍紅細(xì)胞微核與核異常的誘導(dǎo)

如圖1中a箭頭所示，正常紅細(xì)胞呈橢圓形，形狀規(guī)則，細(xì)胞核位于近中央位置。而在不同濃度BaP處理后，泥鰍血紅細(xì)胞出現(xiàn)核異常情況，如核不規(guī)則現(xiàn)象，即圖b箭頭所指，可見泥鰍血紅細(xì)胞核變形。圖c箭頭所指為核空泡現(xiàn)象，圖d所示為微核現(xiàn)象，即細(xì)胞核周圍細(xì)胞質(zhì)會(huì)生出一個(gè)小小的橢圓形的核，一般為主核的1/5～1/20。圖e中箭頭分別指向染色質(zhì)小顆?，F(xiàn)象。這些現(xiàn)象表明泥鰍在BaP脅迫下，血紅細(xì)胞核受到一定的毒害作用。

圖 1 BaP處理下泥鰍紅細(xì)胞微核與核異常

a.正常紅細(xì)胞（×100），b.核變形（×40），c.核空泡（×40），d.微核（×40），e.染色質(zhì)小顆粒（×100）

a. Normal red blood cells（×100）, b. Nuclear deformation（×40）, c. Nuclear cavitation（×40）, d. Micronuclei（×40）, e. Chromatin granules（×100）

表 1 BaP對(duì)泥鰍外周血紅細(xì)胞微核率的影響

注：*＜0.05，表示與對(duì)照組0 μg/L相較差異顯著；**＜0.01，表示差異極顯著。

Note: *P< 0.05, Compared with the control group (0 μg/L) , signifying significant difference; **< 0.01, signifying significant difference.

表1可見，BaP各處理組微核率顯著高于對(duì)照組。在相同暴露時(shí)間，隨著BaP濃度的升高，泥鰍紅細(xì)胞微核率上升極其顯著（＜0.01）；在相同濃度組，泥鰍紅細(xì)胞微核率隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而極顯著上升（＜0.01），且在最高濃度15 μg/L暴露20 d時(shí)達(dá)到最大值。

2.2 BaP對(duì)泥鰍肝臟SOD活性的影響

圖 2 BaP對(duì)泥鰍肝臟SOD活性的影響

注：*＜0.05，表示與對(duì)照組差異顯著；**＜0.01，表示與對(duì)照組差異極顯著；不同字母表示相同濃度組在不同時(shí)間差異顯著。

Note: *<0.05, Compared with the Control Group, signifying significant difference; **<0.01, signifying significant difference, letters represent differences in time with the same concentration gradient.

如圖2所示，與對(duì)照組相比較，暴露時(shí)間達(dá)到5 d時(shí)，3個(gè)BaP濃度處理組泥鰍肝臟SOD活性均呈極顯著升高（＜0.01），同時(shí)，隨著BaP濃度的升高，SOD活性值變化趨勢(shì)表現(xiàn)出先升高后降低的特點(diǎn)，低濃度組（5 μg/L）BaP脅迫下，SOD活性值較其他2組（10 μg/L、15 μg/L）高。除高濃度組（15 μg/L）20 d時(shí)，各處理組泥鰍肝臟SOD活性與對(duì)照組相比均有極顯著差異（＜0.01）。

3個(gè)濃度處理組（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）泥鰍在暴露時(shí)間達(dá)到10 d時(shí)SOD活性均顯著下降（＜0.01），20 d時(shí)活性又顯著上升（＜0.01），在中、高劑量組（10 μg/L、15 μg/L）下SOD活性值達(dá)到該組最低值。從暴露時(shí)間來(lái)看，3個(gè)濃度組SOD活性變化隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升的趨勢(shì)，在脅迫中、中后期（10、15 d）時(shí)SOD活性達(dá)到最低值。

2.3 BaP對(duì)泥鰍肝臟CAT活性的影響

圖 3 BaP對(duì)泥鰍肝臟CAT活性的影響

注：*＜0.05，表示與對(duì)照組差異顯著；**＜0.01，表示與對(duì)照組差異極顯著；不同字母表示相同濃度組在不同時(shí)間差異顯著。

Note: *<0.05, Compared with the Control Group, signifying significant difference; **<0.01, signifying significant difference, letters represent differences in time with the same concentration gradient.

BaP脅迫下，泥鰍肝臟CAT活性變化如圖3所示。與對(duì)照組相比，3個(gè)BaP濃度組（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）暴露5d泥鰍肝臟CAT活性均顯著升高（＜0.01），同時(shí)，隨著BaP濃度的升高，泥鰍肝臟CAT活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。3個(gè)BaP濃度組（5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L）中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，泥鰍肝臟CAT活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在暴露中期（10 d）達(dá)到各濃度組最低值，分別為9.997、11.044、11.677 U/mL，在暴露后期（20 d）時(shí)達(dá)到最高值，分別為31.487、37.167、29.788 U/mL。且在相同濃度組不同暴露時(shí)間比較下，泥鰍肝臟CAT活性前、中期（5 d、10 d）并未有明顯變化，中后、后期（15 d、20 d）呈顯著升高。圖中可見，隨著BaP濃度的升高，CAT活性值會(huì)隨之下降，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這也說(shuō)明，BaP脅迫濃度的升高，導(dǎo)致泥鰍肝臟CAT活性恢復(fù)緩慢。

3 討論

3.1 BaP對(duì)泥鰍遺傳毒性效應(yīng)

魚類外周血紅細(xì)胞微核率的變化，反映其染色體是否出現(xiàn)損傷和損傷程度，進(jìn)一步指示環(huán)境污染情況[11]。蔣玫等[12]通過(guò)彗星實(shí)驗(yàn)研究BaP對(duì)縊蟶紅細(xì)胞DNA損傷發(fā)現(xiàn)，隨著BaP濃度的增大和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞DNA鏈斷裂損傷程度以及帶尾彗核DNA百分比增加。姜姍等[13]在研究重金屬對(duì)泥鰍細(xì)胞DNA損傷及金屬硫蛋白表達(dá)影響中發(fā)現(xiàn)，暴露在不同濃度硫酸銅和氯化鋅溶液中，泥鰍鰭細(xì)胞拖尾率、彗尾DNA比例以及彗尾尾長(zhǎng)均顯著高于對(duì)照組，表現(xiàn)出一定的遺傳毒性。

本研究通過(guò)20 d的靜水實(shí)驗(yàn)法發(fā)現(xiàn)，BaP脅迫下泥鰍外周血紅細(xì)胞出現(xiàn)微核、胞質(zhì)突起、核固縮等核異?，F(xiàn)象，血紅細(xì)胞微核率與BaP暴露濃度以及暴露時(shí)間呈正相關(guān)，說(shuō)明一定濃度BaP暴露會(huì)誘導(dǎo)泥鰍血紅細(xì)胞微核以及核異常現(xiàn)象，這種損傷會(huì)隨著BaP脅迫濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，可能是由于BaP脅迫使得泥鰍紅細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂和損傷，形成微核，導(dǎo)致微核率升高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了泥鰍血紅細(xì)胞對(duì)環(huán)境污染物BaP響應(yīng)較為敏感，進(jìn)一步應(yīng)用于污染物脅迫下魚類遺傳毒性效應(yīng)的環(huán)境評(píng)價(jià)。

3.2 BaP對(duì)泥鰍氧化毒理效應(yīng)

已有研究表明，當(dāng)生物體在受到污染物誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的自由基時(shí)，體內(nèi)酶促抗氧化保護(hù)機(jī)制會(huì)被激活，超氧歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性可以被誘導(dǎo)或抑制[14-16]。戚珍珠等[17]通過(guò)研究幼齡泥鰍對(duì)壬基酚（Nonylphenol，NP）脅迫的抗氧化酶系響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在15 d的暴露周期內(nèi)泥鰍肝臟SOD以及CAT活性隨NP質(zhì)量濃度增大而升高。Strobel Anneli等[18]探究BaP脅迫下南極魚超氧化物歧化酶的變化中發(fā)現(xiàn)，暴露在10和100 mg/kgBaP下其肝臟SOD水平一直保持在較高水平。

本研究結(jié)果顯示，隨著BaP脅迫濃度的升高，泥鰍肝臟SOD活性呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的特點(diǎn)。在各個(gè)BaP暴露濃度組，泥鰍肝臟SOD活性在暴露早期（5～10 d）表現(xiàn)出抑制作用，這說(shuō)明BaP對(duì)泥鰍肝臟造成了氧化損傷，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性升高說(shuō)明泥鰍在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，體內(nèi)抗氧化保護(hù)機(jī)制被激活，抵御自身受到的氧化損傷。尚泰宇[19]在氰氟草酯脅迫對(duì)泥鰍抗氧化酶活性影響研究中發(fā)現(xiàn)，氰氟草酯脅迫對(duì)泥鰍體內(nèi)SOD活性影響隨著暴露濃度的升高表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在高濃度BaP暴露下，泥鰍肝臟SOD活性雖也表現(xiàn)出先抑制后誘導(dǎo)，但其誘導(dǎo)作用并沒有低濃度的顯著，我們判斷可能是因?yàn)楸讲④艑?duì)泥鰍肝臟造成了不可逆損傷，導(dǎo)致泥鰍SOD活性恢復(fù)緩慢。

過(guò)氧化氫酶存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過(guò)氧化體中，它的主要作用是催化H2O2分解為H2O與O2，避免生成非常有害的-OH[20,21]。研究表明，隨著污染物濃度的升高，生物體內(nèi)CAT活性會(huì)隨著SOD活性上升同時(shí)被激活，抵御減少氧化應(yīng)激損傷，但隨著污染物濃度的持續(xù)升高、不斷對(duì)生物體造成破壞導(dǎo)致CAT活性被抑制。蔣潤(rùn)蘭等[22,23]通過(guò)對(duì)菲脅迫下中華絨螯蟹急性毒性效應(yīng)的研究表明，各濃度梯度菲暴露下肝胰腺和鰓組織中的CAT活性被誘導(dǎo)呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。再者，關(guān)曉燕等[24]通過(guò)研究蝦夷扇貝暴露在BaP下血清SOD、CAT活性發(fā)現(xiàn)，SOD活性與CAT活性變化在前期呈顯著負(fù)相關(guān)、后期顯著負(fù)相關(guān)，且具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。

在本研究中，隨著BaP濃度的升高，泥鰍肝臟中CAT活性呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的特點(diǎn)。暴露前期（5～10 d），泥鰍肝臟CAT活性表現(xiàn)出抑制作用，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)（15～20 d）CAT活性升高，表明泥鰍對(duì)所處環(huán)境已經(jīng)有了一定的適應(yīng)。比較可見，隨著BaP濃度的升高，泥鰍肝臟SOD和CAT活性都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。出現(xiàn)這種情況的原因可能是低濃度BaP暴露下，泥鰍體內(nèi)染毒、內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，體內(nèi)SOD和CAT活性被誘導(dǎo)；但隨著BaP暴露濃度的升高，生物的自我調(diào)節(jié)能力有限、機(jī)體損傷嚴(yán)重，故SOD和CAT活性被抑制。同時(shí)，在各濃度梯度組中，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，泥鰍肝臟SOD和CAT活性都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。這可能是由于在暴露早期泥鰍急性染毒各項(xiàng)生理指標(biāo)下降，導(dǎo)致暴露早、中期（5 d、10 d）泥鰍肝臟SOD、CAT活性下降，隨后各項(xiàng)生理指標(biāo)逐漸恢復(fù)，機(jī)體抵御減少氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致SOD、CAT活性被誘導(dǎo)。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)苯并芘脅迫下對(duì)泥鰍肝臟CAT活性與SOD活性誘導(dǎo)存在一定的差異，這主要體現(xiàn)在暴露早期對(duì)SOD抑制作用較CAT強(qiáng)；隨著BaP暴露時(shí)間延長(zhǎng)，BaP對(duì)CAT活性的誘導(dǎo)作用較SOD顯著，這也說(shuō)明CAT活性對(duì)BaP脅迫更為敏感。Liang J等[25]在十溴聯(lián)苯醚和鐵對(duì)蚯蚓抗氧化酶系影響研究中，也得到了CAT活性誘導(dǎo)作用更為敏感的結(jié)果。

因此，我們?cè)趹?yīng)用抗氧化酶系對(duì)水體內(nèi)苯并芘監(jiān)測(cè)時(shí)，生物體血紅細(xì)胞微核率、SOD活性、CAT活性這幾個(gè)指標(biāo)可用于監(jiān)測(cè)環(huán)境，且從SOD活性與CAT活性兩項(xiàng)指標(biāo)的變化進(jìn)行分析，依據(jù)二者作用的不一致性綜合分析，能夠更準(zhǔn)確的分析苯并芘的環(huán)境毒理學(xué)效應(yīng)。

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Effects of Benzo(a)pyrene Stress on Erythrocyte and Antioxidant Enzyme Activities in the Peripheral Blood of

YANG Na1,2, PAN Peng-tao1,2, DONG Xu1,2, FAN Pei-yue1,2, WU Hang-li1,2, WANG Jia1,2, LEI Xin1,2*

1.716000,2.716000,

To study the effect of Benzo(a)pyrene on erythrocyte and antioxidant enzyme activities in fish, loach was exposed to 0,5,10 and 15 μg/L BaP solution for 20 days. During the BaP treatment, the blood and liver were collected on 5,10,15 and 20 days. The erythrocyte micronucleus and nuclear abnormality were detected by blood smear, the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in liver were measured by pyrogallol autoxidation and ammonium molybdate colorimetry. The results showed that: (1) With the increase of BaP concentration and exposure time, the micronucleus rate of erythrocytes ofincreased significantly. (2) With the increase of BaP concentration, the activities of SOD and CAT ofincreased at first and then decreased during 20 days of exposure. Therfore, BaP stress could induce certain genotoxicity and oxidative toxicity to, and the toxicity had time-dose effect.

Benzo(a)pyrene;; blood erythrocyte; antioxidant enzymes

S917

A

1000-2324(2021)06-0936-06

2021-04-27

2021-05-15

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(2021JM-417);延安市科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2017HM-05);陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(S201910719037)

楊娜(1997-),女,在讀研究生,主要從事水生態(tài)毒理學(xué)研究. E-mail:yangna970618@126.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:leizz66@126.com