馬 莉，王佳惠，毛 靖，蘇立林，李秀娟，張 良

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150040）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）可定義為與血管性腦損傷相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認知能力下降和記憶力減退[1]。據(jù)報道，隨著人口老齡化和腦血管疾病風險的增加，全球癡呆患者的數(shù)量將在2030年達到6 600萬，在2050年達到1.2億。VD發(fā)病率僅次于阿爾茨海默氏病，約占所有癡呆的15%～20%[2]。目前對VD的發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與神經(jīng)生化機制、細胞和分子機制、炎性反應(yīng)及遺傳等機制相關(guān)，而炎性反應(yīng)機制在急性腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起主要作用[3]。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（silent information regulator 1，SIRT1）在海馬神經(jīng)元內(nèi)表達豐富，是細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點，SIRT1通過去乙酰化作用抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）炎性信號傳導(dǎo)，在調(diào)控血管性認知功能障礙以及細胞凋亡方面起著重要作用[4]。因而本研究擬通過改良的2-VO法制作VD模型，探討VD發(fā)展過程中認知功能障礙的病理變化和可能的分子生物學機制。

1 材料方法

1.1 實驗動物

選用純系Wistar健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量為（250±30）g，均由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要實驗試劑與儀器

TGL—16G 冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；電動玻璃勻漿機（寧波新芝科學儀器研究所）；一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；規(guī) 格：0.20 mm×13 mm）；KWD—808I脈 沖電療儀（常州市武進長城醫(yī)療器械有限公司）；Morris水迷宮系統(tǒng)?？筍IRT1抗體、抗NF-κB p65抗體、抗β-actin抗體；BCA蛋白定量試劑盒；ECL化學發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 模型制備及分組

60只Wistar大鼠隨機分為4組，每組各15只，分別為：假手術(shù)組、模型組、西藥組和電針組。實驗動物在實驗室進行1周適應(yīng)性訓(xùn)練后，應(yīng)用改良2-VO阻斷法進行造模。各組大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛，按照0.35 mL·100 g-1的計量進行麻醉，仰臥位固定頭部和四肢，頸部備皮消毒鋪巾，在頸部正中行切口，充分暴露兩側(cè)頸總動脈，動脈夾阻斷血流20 min后恢復(fù)血流10 min，接著再次阻斷血流 20 min，如此重復(fù)操作3次[11]。第3次血流恢復(fù)后用生理鹽水浸潤過的4號絲線結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈，觀察生命體征狀態(tài)平穩(wěn)后縫合傷口、常規(guī)消毒。假手術(shù)組暴露頸總動脈后僅進行迷走神經(jīng)鈍性剝離，各組大鼠肌肉注射20萬單位青霉素以預(yù)防傷口感染。手術(shù)造模成功后，待各組大鼠傷口愈合后同時進入治療階段。

1.4 干預(yù)方法

電針組選穴按照于致順老師頭針療法，選取神庭至囟會及其左右各1寸、2寸的平行線處叢刺，針刺方向為向后方斜刺，大鼠取穴參照《實驗動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學》。針刺后選取左右最外側(cè)兩針連接脈沖電療儀，波形選用疏密波、頻率2 Hz、時間20 min，電針強度以針身或者大鼠耳部輕微顫抖為度，電針結(jié)束后繼續(xù)留針10 min，每日1次。西藥組、模型組與假手術(shù)組予以相同條件下抓取，并在特制的鼠板上停留，抓取捆綁次數(shù)同電針組。西藥組用實驗濃度為40 mg·mL-1的腦復(fù)康水溶液，劑量按照10 mL·kg-1進行灌胃，每日1次。模型組與假手術(shù)組均用生理鹽水灌胃，給藥體積及頻次同西藥組，每日1次，連續(xù)給藥30 d。

1.5 檢測指標

1.5.1 Morris水迷宮檢測 使用Morris水迷宮評估各組大鼠空間學習和記憶能力。測試前進行適應(yīng)性訓(xùn)練4 d，避免大鼠在進行實驗時產(chǎn)生應(yīng)激性刺激。

第一階段為定位航行實驗，連續(xù)5 d，每天訓(xùn)練4次，每只大鼠每次放入水中的次序和位置保持一致。記錄大鼠在120 s內(nèi)成功發(fā)現(xiàn)隱藏站臺需要的時間，保證平臺停留時間超過10 s且沒有再次跌落水中后停止計時，4次尋找到平臺的平均成績即為該大鼠的逃避潛伏期。若在120 s規(guī)定時間內(nèi)大鼠還未發(fā)現(xiàn)站臺則人為地將其引導(dǎo)爬上站臺后停留15 s，并記錄此次逃避潛伏期為120 s。第二階段為空間探索實驗，在第6 d撤掉隱藏的站臺，將各組大鼠在同一位置依次放入水迷宮中，記錄各組大鼠在120 s內(nèi)跨越原平臺位置次數(shù)。

1.5.2 Western blot法檢測 大腦海馬區(qū)SIRT1，NF-κB p65的蛋白表達水平，預(yù)冷生理鹽水沖洗海馬組織，將組織剪碎充分研磨，加入配置好的裂解液，離心后吸取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度。行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。使用TBST緩沖液漂洗PVDF膜，隨后放入一抗稀釋液中，置于4 ℃冰箱反應(yīng)過夜。TBST洗膜15 min，重復(fù)3次，隨后孵育二抗，再次洗膜后ECL顯影，掃描后存檔。應(yīng)用Image—Pro Plus軟件進行蛋白灰度分析，將目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0版軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）來表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異提示有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測結(jié)果

定位航行實驗中，模型組的逃避時間明顯增長，差異具有顯著性（P＜0.05）。在空間探索實驗中，模型組的象限跨越次數(shù)明顯少于假手術(shù)組（P＜0.05），表明大鼠學習記憶能力下降，該模型成立。與模型組相比電針組、西藥組的逃避潛伏時間明顯縮短（P＜0.05），跨越原平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05），電針組與西藥組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明西藥組和電針組都能持續(xù)有效地改善VD大鼠的學習記憶能力。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠的逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較（±s，n= 15）

表1 各組大鼠的逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較（±s，n= 15）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05

組別逃避潛伏期/s 穿臺次數(shù)/次第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術(shù)組 48.23±2.59 43.41±3.72 36.67±4.17 26.58±4.18 23.83±4.14 9.13±1.30模型組 77.71±3.44# 64.48±8.35# 56.46±3.84# 45.80±4.92# 41.38±5.16# 2.66±1.23#西藥組 51.71±1.91#△ 49.38±4.52#△ 41.01±2.82#△ 36.91±3.62#△ 32.81±3.93#△ 6.60±1.35#△電針組 51.81±3.44#△▲ 48.23±4.82#△▲ 39.51±2.35#△▲ 35.50±4.53#△▲ 31.90±3.72#△▲ 7.20±1.14#△▲

2.2 各組大鼠海馬區(qū)SIRT1/NF-κB通路相關(guān)蛋白水平的表達

與假手術(shù)組相比，模型組SIRT1蛋白表達降低（P＜0.05），NF-κB p65蛋白表達明顯升高（P＜0.05），表明模型組大鼠海馬區(qū)形成了組織損傷，實驗?zāi)Ｐ途哂杏行?。與模型組相比，電針組和西藥組SIRT1表達升高（P＜0.05），NF-κB p65表達明顯降低（P＜0.05），電針組與西藥組相比無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結(jié)果提示電針額區(qū)可調(diào)整VD大鼠海馬區(qū)SIRT1/NF-κB信號通路的傳導(dǎo)。各組大鼠海馬區(qū)SIRT1、NF-κB p65蛋白表達比較以及電泳圖見圖1。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)SIRT1、NF-κB p65蛋白表達比較以及電泳圖

3 討論

血管性癡呆常發(fā)生在中風等一系列腦血管疾病之后，主要臨床表現(xiàn)為記憶力減退、善忘、反應(yīng)遲鈍、肢體無力、智能低下等[5]。VD是現(xiàn)代醫(yī)學的命名，在中醫(yī)學中被劃分為“文癡”“呆病”以及“中風”等范疇?！夺樉拇蟪伞分杏涊d“心性癡呆，悲泣不已”，《靈樞·海論》中提及“腦為髓之海，髓海不足，則腦轉(zhuǎn)耳鳴……懈怠安臥”。VD基本病機為本虛標實，以腎精虧虛為本，痰濁阻絡(luò)為標。隨著年齡增長，素體正虛、髓海漸空，體內(nèi)氣血津液功能失調(diào)、互生瘀結(jié)日久損傷腦絡(luò)，致使腦髓失養(yǎng)、神明不行而致呆病[6]。頭針療法是在傳統(tǒng)針灸學及人體解剖學、神經(jīng)生物等學科的基礎(chǔ)上發(fā)展形成的，頭部是十四經(jīng)穴、奇穴以及新穴分布最集中的區(qū)域，諸多頭穴皆與髓海相通，可運行經(jīng)氣、濡養(yǎng)髓海，發(fā)揮調(diào)節(jié)人體氣血陰陽的作用[7]。

額區(qū)叢刺法源于我校于致順教授頭針療法，其“針場”假說結(jié)合了現(xiàn)代大腦皮層定位理論與傳統(tǒng)中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)學說，通過刺激局部大腦皮層及有關(guān)部位，調(diào)動和激發(fā)機體自我調(diào)節(jié)機制，改善腦部循環(huán)及神經(jīng)功能，對相應(yīng)部位的病理狀態(tài)進行動態(tài)調(diào)整[8]。于老將頭部劃分為7個區(qū)，其中額區(qū)在解剖學中為額葉前部，具有進行記憶、思維、情緒、分析以及感覺信息加工等功能，從神經(jīng)定位的層面看，額葉前部是額葉聯(lián)合區(qū)，主要負責精神情感活動[9]。神庭、囟會在七區(qū)劃分中屬額區(qū)，神庭為督脈、足太陽經(jīng)及陽明經(jīng)之會，其位于腦海前庭，為神志所在，主要有寧神、開竅、疏郁之功[10]?！夺樉难狻穂11]中解釋：“人當思慮之際，神識會于囟門”，又如《針灸甲乙經(jīng)》所言：“囟會……督脈氣所發(fā)”，可見針刺神庭、囟會穴可激發(fā)督陽、調(diào)養(yǎng)元神。叢刺是以督脈為基線，在縱向維度的基礎(chǔ)上、亦從橫向出發(fā)，對頭部的刺激由原來的單一的點刺或是線刺擴展到面狀刺激[12]。然而電針相較于普通針刺，其刺激量更大，因此更能激發(fā)叢刺產(chǎn)生的“場”，進一步調(diào)節(jié)腦功能。因此，額區(qū)叢刺聯(lián)合電針可用于治療智能及精神神志類疾病，包括記憶力減退、癲、狂、癇等神志變化癥狀[13]。筆者通過治療血管性癡呆的臨床經(jīng)驗以及前期成果發(fā)現(xiàn)[14]，該方法不僅能夠促進腦部神經(jīng)元恢復(fù)，對血管性癡呆患者的臨床癥狀也有較好的改善。

VD的發(fā)病與腦組織慢性低灌注及代償性灌注增多引起的缺血再灌注損傷密切相關(guān)[15]，而大腦海馬區(qū)神經(jīng)元對腦缺血反應(yīng)最為敏感，是學習和記憶能力形成的重要部位[16]。因此本實驗中采用改良的2-VO法制作VD動物模型，此方法特點為先形成急性缺血再灌注，最后造成慢性低灌注狀態(tài)，與VD形成機制最為接近，容易對海馬、大腦皮層的神經(jīng)元造成損傷[17]。本實驗應(yīng)用Morris水迷宮實驗研究和評估動物認知能力[18]，結(jié)果提示電針組的各項實驗成績明顯優(yōu)于模型組，表明電針額區(qū)能夠顯著提高VD大鼠空間位置感和方向感的學習水平。越來越多的資料表明，炎性機制在VD的發(fā)病機制中的地位日益受到重視，腦組織缺血缺氧發(fā)生后，膠質(zhì)細胞活化增多，促使細胞內(nèi)鈣超載、炎性因子及氧自由基釋放[19]。局部神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞被激活后，通過釋放白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子從而觸發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致其他細胞因子及炎性代謝產(chǎn)物共同促使白細胞遷移至炎癥組織的損傷區(qū)域，導(dǎo)致血管再閉塞。白細胞還可以產(chǎn)生蛋白水解酶和其他效應(yīng)分子, 引起神經(jīng)元的直接損傷[20]。SIRT1是一種蛋白去乙?；?，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性，其功能多樣化且復(fù)雜，主要可通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達使轉(zhuǎn)錄因子脫乙?；?，以及細胞應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)保護、細胞衰老凋亡等生物學效應(yīng)，并且SIRT1在海馬神經(jīng)元內(nèi)表達豐富。NF-κB是幾乎存在于所有動物的細胞中的一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠控制DNA轉(zhuǎn)錄、細胞因子產(chǎn)生和細胞存活，多數(shù)以異源二聚體 p65的形式存在，廣泛參與細胞對各種刺激的應(yīng)答[21]。NF-κB也是腦缺血損傷后反應(yīng)最早的關(guān)鍵炎癥因子，通過增強TNF-α、I L-1β等促炎性因子基因的表達，間接促進炎性反應(yīng)[22]。SIRT1發(fā)生去乙?；磻?yīng)后促使其下游因子NF-κB p65和p53去乙?；?，進而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，同時抑制IκBα磷酸化，被激活的NF-κB p65可促進促炎因子的合成和釋放，而這些被激活的促炎因子又反過來活化NF-κB，造成持續(xù)性的炎性反應(yīng)[23]。

SIRT1/NF-κB信號通路可參與VD病理機制中炎性因子的產(chǎn)生，當對SIRT1進行活性誘導(dǎo)時，可通過抑制NF-κB信號活化，防止炎癥引起的神經(jīng)元損傷，降低細胞凋亡的發(fā)生。大量的研究資料證明，SIRT1/NF-κB信號通路能夠發(fā)揮細胞生長、代謝、應(yīng)激及炎性反應(yīng)等多種病理生理過程，如應(yīng)用電針改善肥胖II型糖尿病大鼠胰島素抵抗[21]，溫針灸療法有效降低RA大鼠血清炎性因子[24]等諸多論述，逐漸成為各類疾病研究治療的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠SIRT1蛋白表達明顯減少，NF-κB p65表達明顯增多，電針組大鼠SIRT1蛋白表達水平顯著升高，NF-κB p65表達降低，促炎因子表達明顯減少，表明電針額區(qū)可上調(diào)SIRT1蛋白的表達，降低磷酸化NF-κB的水平，抑制促炎因子表達，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。