肖石高，何夢雪，張振東，王玉榮，侯強川

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北 宜昌 444199；3.宜昌市乳酸菌發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 444199；4.湖北文理學(xué)院乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

0 引 言

人類腸道中寄居著種類多樣且數(shù)量龐大的微生物，它們影響著人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，并與人體健康密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與糖尿病[2-3]、脂肪肝[4]、心血管疾病[5]和自閉癥[6-7]等多種疾病密切相關(guān)。同時，不同年齡的人群腸道菌群亦存在較大差異，這可能與衰老導(dǎo)致的人體身體素質(zhì)和消化機能下降、代謝減慢等一系列變化有關(guān)[8]。此外，平均壽命不同的地區(qū)，老年人腸道菌群組成展現(xiàn)出明顯差異，例如Park等人的研究報告顯示韓國長壽村40歲以上人群腸道中的乳酸菌如乳酸桿菌屬和乳球菌屬的相對含量遠(yuǎn)高于城市居民[9]。這些研究一方面表明乳酸菌與長壽之間存在密切關(guān)系，另一方面，長壽老人腸道菌群可以作為益生乳酸菌的重要來源之一。但截止目前，關(guān)于中國長壽老人腸道乳酸菌多樣性的研究尚少，使得后續(xù)對基于長壽老人腸道菌群的益生乳酸菌分離和篩選缺少方向。

之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乳酸菌的持續(xù)攝入對包括老年人在內(nèi)的各年齡段人群健康起著重要的調(diào)節(jié)作用[10]。隨著人們對營養(yǎng)和保健的追求，作為益生乳酸菌重要載體的酸奶受到越來越多消費者的親睞。酸奶是由原料乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制作而成，在發(fā)酵的過程中乳糖、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子會部分分解為小分子的乳酸、肽、氨基酸、脂肪酸等[11]，這一方面提高了牛奶的風(fēng)味，另一方面也更容易被人體消化吸收，降低了乳糖不耐癥等情況的發(fā)生。除此之外，酸奶還具有平衡人體腸道菌群、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫能力和抗氧化等作用[12-14]。在酸奶制作的過程中，影響其品質(zhì)的一個重要因素是發(fā)酵劑的發(fā)酵特性，所以制作高品質(zhì)酸奶的前提是篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性和益生特性的乳酸菌菌株[15-16]。因此，通過對長壽老人腸道乳酸菌多樣性進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上評價和篩選性狀優(yōu)良的乳酸菌具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究首先對采集自恩施地區(qū)長壽老人的糞便樣品通過純培養(yǎng)方法對樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離與鑒定，確定了長壽老人腸道中的優(yōu)勢乳酸菌。在此基礎(chǔ)之上，對其優(yōu)勢乳酸菌菌株發(fā)酵制作的發(fā)酵乳使用電子鼻、電子舌和高效液相色譜等檢測手段進(jìn)行了評價與分析，為后續(xù)具有優(yōu)良益生特性菌株的篩選開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、乙酸鈉、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、乙醇、偏重亞硫酸鉀、碳酸鈉和碳酸鈣（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌16S：rRNA通用引物27F/1495R，武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；溶菌酶、蛋白酶K、2×PCR：mix和p MD19-T載體，寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物清潔試劑盒，愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；陰離子溶液、陽離子溶液、內(nèi)部溶液和參比溶液，日本Insent公司；鹽酸、硼酸、硫酸、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸銅、酚酞、硝酸銀、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、鉻酸鉀和硫酸鉀（均為分析純），成都市科龍化工試劑廠；酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸（優(yōu)級純），西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈和異丙醇（色譜純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FluorChem：FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國FluorChem公司；DG250厭氧工作站，英國DWS公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；vetiri梯度基因擴增儀，美國AB公司；ECLIPSE：Ci生物顯微鏡，日本Nikon公司；LC-20ADXR高效液相色譜儀，日本島津公司；Inertsil：ODS-SP：C18色譜柱（150×4.6mm，5μm），日本島津公司；V-1800型可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SA-402B電子舌，日本Insent公司；CYB40-10S高壓均質(zhì)機，上海東華高壓均質(zhì)機廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

糞便樣品收集自恩施市花果山社會福利院和六角亭老街街坊敬老院；老人年齡為90～95歲（7女2男），且近3個月未服用益生菌或抗生素藥物，無感冒，腸炎等病癥。糞便樣品采集時間為早上6：00～9：00。樣品采集后，裝入?yún)捬醮糜诘蜏夭蓸酉渲?，迅速帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 乳酸菌的分離與鑒定

先將糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋：稱取10 g糞便到含有90 mL無菌生理鹽水（0.85%的氯化鈉溶液）的三角瓶中并混勻（10-1稀釋液），取混勻的稀釋液0.5 mL移入于另一個含4.5 mL生理鹽水的試管中混勻（為10-2稀釋液），接著取0.5 mL的稀釋液重復(fù)上述步驟，分別得到10-1到10-7梯度的稀釋樣品，取其中的10-4、10-5、10-6梯度的稀釋液各100 mL涂布于含1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基平板。將平板放入溫度為37℃的厭氧工作站培養(yǎng)48 h左右。隨后挑取平板中有鈣溶圈的單菌落，使用MRS固體培養(yǎng)基劃線純化，通過革蘭氏染色檢驗菌種形態(tài)與純度后，將菌株保存在含20%甘油的MRS培養(yǎng)基，在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過CTAB法提取上述純化過的菌株DNA，并以之為模板，使用細(xì)菌16SrRNA通用引物27f（5’–AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和1495r（5’–CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）進(jìn)行PCR擴增。擴增體系為25μL的2×PCR mix（含Mg2+，dNTP和rTaq），1μL 27f（10 mmol/L），1μL 1495r（10 mmol/L），10～50 ng DNA模板，加無菌dd H2O至50μL。反應(yīng)條件：94℃4 min預(yù)變性；94℃60 s變性，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃延伸l0 min。將PCR產(chǎn)物純化后，連接到T-載體并轉(zhuǎn)化E.coli top10大腸桿菌細(xì)胞，在含有氨芐青霉素鈉的平板上過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆子，送到武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

將測序得到的序列拼接與去引物后，提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對，下載相似度較高的模式菌序列與本研究的菌株序列一起使用MEGA X軟件基于鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（設(shè)置Bootstrap為1 000次），以確定菌株的系統(tǒng)分類地位。

1.3.3 發(fā)酵乳的制作工藝流程

發(fā)酵乳的制作參照楊發(fā)容等[17]的方法進(jìn)行。發(fā)酵乳的總體工藝流程為：奶粉→制備復(fù)原乳→水合→均質(zhì)→殺菌→降溫→接種乳酸菌→發(fā)酵→冷卻后熟→成品（4℃下保藏）。具體流程為，首先制備復(fù)原乳，使用的奶粉、蔗糖和水按照11.5∶6.5∶82的質(zhì)量比混合均勻；水合：將復(fù)原乳于65℃保溫30 min；均質(zhì)：將灌裝好的奶液進(jìn)行兩段均質(zhì)，一段20 MPa，第二段4 MPa；殺菌：將均質(zhì)好的奶液加熱至95℃左右，保溫5 min；接種乳酸菌：提前活化菌體，按照5×106CFU/mL復(fù)原乳的比例接入提前制備好的乳酸菌懸液；發(fā)酵：將加完菌液的復(fù)原乳置于42℃的恒溫箱中發(fā)酵24 h；后熟：將發(fā)酵凝乳好的乳制品置于4℃的冷藏柜中冷藏24 h，完成后熟。

1.3.4 發(fā)酵乳氣味的測定

稱取10 g發(fā)酵乳樣品于25 mL樣品瓶中，放置至室溫，然后參照朱丹實等[18]的方法對發(fā)酵乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測。具體參數(shù)設(shè)置為：傳感器清潔時間為90 s，調(diào)零時間為5 s，進(jìn)樣吸氣流量為200 mL/min，測定時間為60 s，樣品間間隔90 s，最終選取各樣品在49 s、50 s和51 s時的響應(yīng)值進(jìn)行分析。

1.3.5 發(fā)酵乳的滋味的測定

稱取50 g發(fā)酵乳樣品，加入150 mL去離子水稀釋，設(shè)置轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min；收集上清液，棄沉淀，然后參照郭壯等[19]的方法對其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）相對強度進(jìn)行檢測。

1.3.6 發(fā)酵乳的有機酸含量測定

稱取2.0 g發(fā)酵乳樣品至10 mL的容量瓶中，使用流動相（0.01 mol/L的K2HPO4）定容至10 mL，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液，121℃高壓處理15 min后，再次12 000 r/min離心10 min，然后取上清液過0.22μm微孔纖維素濾膜，濾液備用。參照楊成聰?shù)萚20]的方法對發(fā)酵乳中有機酸的含量進(jìn)行檢測：檢測器使用紫外-可見光檢測器，檢測波長為215 nm，流動相為0.01 mol/L的K2HPO4（p H值為2.30），進(jìn)樣量20μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為25℃。

1.3.7 統(tǒng)計分析

使用Mann-Whiney檢驗對發(fā)酵乳的組間差異進(jìn)行分析，使用vegan包進(jìn)行主成分分析法（principal component analysis，PCA）以對分析發(fā)酵乳的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行排序分析；并使用Origin 2017軟件繪制箱形圖和散點圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 長壽老人腸道乳酸菌分離與分子鑒定

本研究通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法，在厭氧條件下，從恩施長壽老人的糞便樣品中分離和純化得到28株菌株，并基于細(xì)菌16SrRNA進(jìn)行了鑒定。

基于分離菌株16SrRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。由圖1可知，所得到的28株乳酸菌被鑒定為2個屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）和腸球菌屬（Enterococcus），進(jìn)一步歸為6個種。分離到的28株菌中的HBUAS54003等12株菌被鑒定為唾液乳桿菌（L.salivarius）；HBUAS54006等9株菌被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）；菌株HBUAS54038被鑒定為泰國腸球菌（Enterococcus thailandicu）；菌 株 HBUAS54037、HBUAS54019和HBUAS54036與Enterococcus faeciumLMG11423T的進(jìn)化關(guān)系較近，被鑒定為Enterococcus faecium；菌株HBUAS54027被鑒定為植物乳桿菌（L.plantarum）；菌株HBUAS54005和HBUAS54022被鑒定為粘膜乳桿菌（L.mucosae）?？偠灾?，從恩施地區(qū)長壽老人腸道分離到的乳酸菌以唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌為主。

圖1 恩施地區(qū)長壽老人腸道中乳酸菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 發(fā)酵乳氣味品質(zhì)評價分析

來源于人體腸道的乳酸菌一般具有較好的胃酸、膽鹽和消化液的耐受能力，發(fā)揮益生功效的潛力往往也較強[21]。根據(jù)衛(wèi)生部印發(fā)的《可用于食品的菌種名單》（2016版），唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌均可在食品工業(yè)中使用，因此，本研究將在恩施長壽老人腸道中分離株最多的唾液乳桿菌（共12株）和發(fā)酵乳桿菌（共9株）分別用于發(fā)酵乳的制備，并對發(fā)酵乳的氣味和滋味品質(zhì)進(jìn)行評價，以初步篩選適用于發(fā)酵乳制作的菌種。首先，使用電子鼻技術(shù)對各發(fā)酵乳樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了測定，其結(jié)果如表1所示。

由表1可知，以恩施長壽老人糞便樣品中分離出的唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌制備的發(fā)酵乳在多個傳感器指標(biāo)上存在顯著差異，其中W 1C、W 3C和W 5C在唾液乳桿菌組含量顯著較高（P<0.05），而W1S、W 2S和W 3S在發(fā)酵乳桿菌組顯著較高（P<0.05）。該結(jié)果表明，唾液乳桿菌制作的酸奶芳香型風(fēng)味物質(zhì)含量更高，而發(fā)酵乳桿菌制作的酸奶烷烴類和乙醇的含量更高。從發(fā)酵乳香氣的角度考慮，唾液乳桿菌更適合用作發(fā)酵乳生產(chǎn)。

表1 電子鼻各傳感器對發(fā)酵乳響應(yīng)值的差異性分析

2.3 發(fā)酵乳滋味品質(zhì)分析

滋味是發(fā)酵乳的另一個重要品質(zhì)，是人們對食品中味感物質(zhì)的總體感覺。因此，本研究同時使用電子舌技術(shù)對發(fā)酵乳樣品的滋味進(jìn)行了評價，并比較了唾液乳桿菌和發(fā)酵發(fā)酵乳桿菌制備的發(fā)酵乳之間各滋味品質(zhì)的差異，其結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵乳滋味品質(zhì)評價箱型圖

由圖2可知，兩組發(fā)酵乳樣品在苦味、酸味、澀味、咸味、鮮味、后味-A（澀味的回味）和豐度（鮮味的回味）上均表現(xiàn)出極顯著的差異（P<0.05），而在后味-B（苦味的回味）方面無顯著差異（P>0.05）。電子舌的檢測結(jié)果顯示使用唾液乳桿菌制備的發(fā)酵乳在酸味、澀味及后味-A（澀味的回味）顯著強于發(fā)酵乳桿菌組，而苦味、鮮味和咸味上的強度顯著弱于發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵組。酸味作為發(fā)酵乳制品的特征滋味，因此唾液乳桿菌發(fā)酵的發(fā)酵乳在滋味品質(zhì)上具有一定優(yōu)勢。

2.4 發(fā)酵乳氣味和滋味的綜合評價分析

為進(jìn)一步綜合評價唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌制備的發(fā)酵乳的品質(zhì)，我們以電子鼻和電子舌的檢測數(shù)據(jù)基于多元統(tǒng)計進(jìn)行綜合排序分析，得到主成分因子載荷圖（圖3a）和因子得分圖（圖3b）。分析可知，PC1主要由酸味、鮮味、W 1C、W 3C、W 5C、W 1S和W 2S等7個指標(biāo)構(gòu)成，PC2主要由后味A（澀的回味）、苦味、咸味和W 2W等4個指標(biāo)構(gòu)成。PC1中的正相關(guān)指標(biāo)主要是鮮味、W 1S和W 2S等，PC2中的正相關(guān)指標(biāo)主要是苦味和咸味等?；赑CA的因子得分圖可知，兩組發(fā)酵乳樣品在因子得分圖中的空間分布呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，可見不同種乳酸菌菌株制備的發(fā)酵乳在滋味和氣味指標(biāo)方面存在明顯的差異。

圖3 基于PCA的因子載荷圖（a）和因子得分圖（b）

2.5 發(fā)酵乳中有機酸含量的分析

為進(jìn)一步明確唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳制備時產(chǎn)生的有機酸種類和含量，本研究采用高效液相色譜法檢測了2組發(fā)酵乳樣品中的有機酸，見表2。

表2 發(fā)酵乳有機酸含量

由表2可知，兩組發(fā)酵乳樣品中乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的含量存在顯著差異（P<0.05）。其中，唾液乳桿菌組發(fā)酵乳中乳酸和檸檬酸的含量顯著較高，而乙酸和琥珀酸的含量顯著較低。有機酸是水果和蔬菜中的天然呈味劑，被廣泛的應(yīng)用到現(xiàn)代食品工業(yè)中。乳酸是發(fā)酵乳中特征有機酸類型，乳酸的口感較柔和，且不掩蓋發(fā)酵乳本身的芳香[22]。本研究中，唾液乳桿菌發(fā)酵乳的乳酸平均含量是發(fā)酵乳桿菌組的3倍多，因此前者用來發(fā)酵酸乳會凝乳更快，發(fā)酵效率更高，口感更好，用來發(fā)酵酸乳會更有優(yōu)勢，如果與其他產(chǎn)香乳酸菌復(fù)配，則更有利于生產(chǎn)出品質(zhì)優(yōu)良的酸乳。

3 結(jié) 論

從恩施地區(qū)的9份長壽老人糞便樣品分離到了28株乳酸菌，鑒定為2個屬的6個種，其中唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌在分離株中所占的比例最高。以唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌為發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳，并進(jìn)行品質(zhì)評價，發(fā)現(xiàn)以唾液乳桿菌制備的發(fā)酵乳芳香型物質(zhì)、乳酸產(chǎn)量等指標(biāo)均優(yōu)于發(fā)酵乳桿菌，提示唾液乳桿菌在酸奶生產(chǎn)中可能具有更大的潛力。本研究揭示老年人腸道乳酸菌的主要組成類群，并為后續(xù)具有益生功效發(fā)酵乳的制備提供了乳酸菌菌種資源。