陳 虎，謝俊康，陸晶宇，譚健暉，李 鵬，楊章旗

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 國(guó)家林業(yè)和草原局馬尾松工程技術(shù)研究中心 廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002；2.廣西師范大學(xué)，廣西桂林 541001）

萜類化合物是植物次生代謝物中最豐富的一類，在植物防御中起重要作用。萜類合成途徑中，法尼基焦磷酸（FPP）和牻牛兒牻牛兒基二磷酸（GGPP）等前體直接影響萜類合酶（Terpene syn?thase, TPS）形成萜類化合物的種類[1]。萜類已成為植物與環(huán)境互作中的重要信號(hào)分子，是參與植物防御反應(yīng)的植保素及調(diào)控植物部分激素的物質(zhì)[1-2]。激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有利于增加植物萜類物質(zhì)，從而提高植物抗性。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）途徑可調(diào)控萜類物質(zhì)代謝，提高植物抗蟲能力[1,3-4]。水楊酸（Salicylic acid，SA）途徑有利于植物萜類物質(zhì)積累；赤霉素（Gibberellin，GA）代謝途徑中，GAOsCPS1基因參與萜類物質(zhì)的合成[5]。在針葉樹中，JA 途徑增加了冷杉（Abies fabri）根部萜類物質(zhì)合成能力，提高白云杉（Picea glauca）萜類物質(zhì)合成能力和相關(guān)表達(dá)量[6-7]；MeJA 途徑能明顯提高西加云杉（Picea sitchensis）莖中萜類物質(zhì)合成能力[8]；SA 途徑可明顯提高擬南芥（Arabidopsis thaliana）的抗蟲能力[9]，超量表達(dá)萜類合成酶基因，提高亞麻萜類物質(zhì)含量，并參與亞麻薺（Camelina sativa）GA途徑提高抗蟲性[10]。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國(guó)重要的速生用材樹種。在有關(guān)馬尾松的相關(guān)研究中，馬尾松萜類化合物響應(yīng)干旱脅迫，馬尾松體內(nèi)多種萜類物質(zhì)與松材線蟲脅迫表達(dá)呈正相關(guān)，萜類物質(zhì)不同抗蟲性材料差異顯著[11-14]。課題組前期研究表明，外源激素處理對(duì)馬尾松揮發(fā)性萜類物質(zhì)含量產(chǎn)生影響，但馬尾松PmFPP和PmGGPP基因是否受到激素和鈣離子信號(hào)結(jié)合調(diào)控還不清楚。本研究在已獲得的PmFPP和PmGGPP基因基礎(chǔ)上，開展生物信息學(xué)分析和外源信號(hào)物質(zhì)處理對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的研究，以期為探索馬尾松萜類合成途徑基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為馬尾松0.5年生全同胞幼苗，苗木參照DB 45∕T 2384-2021[15]培育。選擇苗高、地徑基本一致，無損傷和病蟲害的苗木作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)處理

設(shè)置11 個(gè)處理，配置75 mg∕L 脫落酸（Abscisic acid，ABA）、50 mg∕L 水楊酸、100 mg∕L MeJA 和150 mg∕L GA，5個(gè)處理為單獨(dú)激素溶液，5個(gè)處理為在激素溶液中分別加入100 mg∕LCaCl2溶液，1 個(gè)處理為100 mg∕LCaCl2溶液，以蒸餾水為對(duì)照（CK），每處理噴施200 mL 溶液。噴施前在溶液中加入3 滴1%吐溫-20。每天上午9 點(diǎn)噴施1 次，均勻噴施于苗木；連續(xù)處理5 天；停止處理后第1、3 和5 天采集同部位成熟針葉，每個(gè)處理采集6株，等量混合后放入液氮保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因序列獲得

PmFPP和PmGGPP基因序列來自課題組前期開展馬尾松抗蟲[14]、花發(fā)育、側(cè)枝發(fā)育[16]和逆境脅迫獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。收集相關(guān)基因序列和信息，通過NCBI 比對(duì)，確定基因cDNA 開放閱讀框核酸序列。

1.3.2 RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄

采用天根公司（北京，中國(guó)）生產(chǎn)的多酚多糖植物RNA提取試劑盒提取所有材料的RNA；采用寶生物公司（大連，中國(guó)）M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，具體步驟參照說明書。RNA 提取和cDNA 逆轉(zhuǎn)錄完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，再將所有樣品濃度稀釋至50 μg∕μL。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

采用Expasy（https:∕∕www.expasy.org∕）在線軟件分析基因的亞細(xì)胞定位、等電點(diǎn)、蛋白分子量和二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Geneious（https:∕∕www.geneious.com∕）軟件進(jìn)行進(jìn)化樹聚類，采用T-Coffee 軟件進(jìn)行基因氨基酸序列比對(duì)，采用NCBI、Motif Scan 軟件對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，采用String（https:∕∕string-db.org∕cgi）進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)，采用MEME（https:∕∕meme-suite.org∕meme∕）分析序列保守基序。

1.3.4 基因表達(dá)分析

采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，以PmC?YP基因作為內(nèi)參[17]。PmCYPF：CAAGGGTTCGTC?GTTCCAC，PmCYPR：GGCAAACTTCTCGCCGTA；Pm?GGPPF:GCCAATGCCATCAATGAAGCTCTG，PmGG?PPR:AGCCAGAAGCGAATACCTCATTGC；PmFPPF:GTGCTTGGCTGGTGTATTGAATGG，PmFPPR:AAC?AAGGTTGTCCACGCCTA GTG。采用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)PmFPP和PmGGPP基因在MeJA、GA、ABA和SA等激素處理和激素與Ca2+共同處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq II（Prefect real-time）TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR體系構(gòu)建和擴(kuò)增（Light Cycle 480II PCR儀），3次生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件作圖，采用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析并對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

PmFPP和PmGGPP基因分別編碼347和385個(gè)氨基酸，分子量分別為39.85 和42.18 kDa，等電點(diǎn)分別為5.08 和5.86，跨膜結(jié)構(gòu)分別有2 和4 個(gè)，亞細(xì)胞分別定位于線粒體和葉綠體、質(zhì)體。兩個(gè)基因均存在Ser、Thr 和Tyr 磷酸化位點(diǎn)，PmFPP 的Tyr 磷酸化位點(diǎn)較多，PmGGPP 只有1 個(gè)；兩個(gè)基因有共同的cdc2、CKII、DNAPK、PKA、PKC 和unsp 磷酸化酶結(jié)合位點(diǎn)，PmFPP 具有特有的EGFR，PmGGPP 具有特有的ATM、cdk5、CKI 和P38mapk 磷酸化酶結(jié)合位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，α-螺旋占比最高，其次為隨機(jī)卷曲，β-轉(zhuǎn)角占比最小。

PmFPP 和PmGGPP 基因結(jié)構(gòu)域均含有聚戊烯合成酶特征1（95 ～ 109 和170 ～ 186 aa）、聚戊烯合成酶特征2（229 ～ 241 和303 ～ 315 aa）和十聚異戊二烯二磷酸合成酶（39～310和121～381 aa）；PmFPP具有細(xì)胞因子受體1 類家族特異性結(jié)構(gòu)域（236 ～291 aa）和Pseudomurein-binding（假細(xì)胞質(zhì)）重復(fù)結(jié)構(gòu)域（181～191 aa）；PmGGPP 具有細(xì)菌胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白（71 ～ 105 aa）和Big-1（bacterial Ig-like do?main 1）結(jié)構(gòu)域（1～6 aa）。

表1 PmFPP和PmGGPP蛋白生物信息學(xué)分析Tab.1 Bioinformatics analysis of PmFPP and PmGGPP protein

2.2 聚類分析

通過NCBI 分別比對(duì)PmFPP和PmGGPP基因的同源基因，選取19 個(gè)物種構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果表明，PmFPP基因核酸序列和氨基酸序列與火炬松（P. taeda）相似性最高，分別為98.37%和99%；PmGGPP基因核酸序列和氨基酸序列與挪威云杉相似性最高，分別為93.52%和100%。通過對(duì)PmFPP 和PmGGPP 序列進(jìn)行保守基序分析，PmFPP的motif 4 含有保守區(qū)RXXS，motif 1 含有保守區(qū)FARM（DDxxD），motif 2 含有保守區(qū)SARM（DDxxD）；PmGGPP 的motif 1 含有保守區(qū)FARM（DDxxxxD）和CxxxC，motif 2含有保守區(qū)SARM（DDxxD）（圖2）。

圖1 馬尾松與其他物種FPP和GGPP基因進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of FPP and GGPP of P.massoniana and other plants

圖2 氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of amino acid sequences

2.3 功能預(yù)測(cè)

將 PmFPP 與擬南芥同源蛋白 SQS1（AT4G34640.1）、AT1G77580（AT1G77580.2）和AT1G21810（AT1G21810.1），PmGGPP與擬南芥同源蛋白G4（AT3G51820.1）、GA1（AT4G02780.1）、GA2（AT1G79460.1）和TPS03（AT4G16740.1）進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果表明，PmFPP 和PmGGPP 通過1個(gè)吡啶核苷酸二硫鍵氧化還原酶（AT1G74470.1）作為連接蛋白完成互作（圖3）。

圖3 PmFPP和PmGGPP蛋白三維結(jié)構(gòu)和基因互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Three-dimensional structures of PmFPP and PmGGPP protein and interaction network of genes

在互作網(wǎng)絡(luò)中，PmFPP（SQS1）能將presqualene diphosphate（PSPP）前體磷酸化轉(zhuǎn)化為2 個(gè)FPP，是甾醇生物合成的關(guān)鍵酶之一。PmGGPP（TPS03）是三環(huán)萜合酶，該基因轉(zhuǎn)錄水平增加對(duì)JA處理或脅迫的響應(yīng)。GA1 在GA 途徑中催化GGPP 到二萜；GA2在GA 途徑將GGPP 轉(zhuǎn)化為copalyl pyrophosphate（CPP）；G4 具有葉綠素合酶活性，可執(zhí)行葉綠素（a和b）的酯化反應(yīng)，這是葉綠素生物合成最后一步，可使GGPP 作為底物；GA3 是貝殼杉烯氧化酶，在GA合成中起關(guān)鍵作用。

PmGGPP（TPS03）未與其他蛋白直接互作，而是和編碼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶HMG1（AT1G76490.1）互作，在類異戊二烯生物合成的第一步中發(fā)揮作用，在葉片黑暗處理中表達(dá)被激活。

PmFPP 和PmGGPP 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，PmFPP 與杜仲（Eucommia ulmoides）的FPS（7bux.1.

A）結(jié)構(gòu)為模板，PmFPP 與模板的一致性為73.68%，GMQE 分值為0.80；以Mint heterotetrameric GPP（3krp.3）結(jié)構(gòu)為模板，PmGGPP 與模板的一致性為70.07%，GMQE 分值為0.68，說明同源建模構(gòu)建的蛋白三維結(jié)構(gòu)是可靠的。PmFPP 具有中心疏水通道的二聚體結(jié)構(gòu)，是萜類生物合成的關(guān)鍵，參與種子發(fā)育和成熟過程。薄荷（Mentha canadensis）GPPS的LSU 和SSU 分別負(fù)責(zé)催化和調(diào)控，與PmGGPP同源，共同作用形成香葉酰焦磷酸，是單萜類物質(zhì)合成的前提。

2.4 基因表達(dá)分析

Ca2+處理的第1天和第5 天，PmFPP基因表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05），第3 天顯著低于CK（P＜0.05），總體提高了基因的表達(dá)量（圖4）。MeJA、GA和SA 處理從第3 天開始和ABA 處理的第5 天，PmFPP基因表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05）；激素+Ca2+處理后，MeJA 和GA 在第5 天、ABA 從第1 天開始及SA 從第3 天開始基因表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05）。激素和激素+Ca2+的處理在第3天和第5 天基因表達(dá)量顯著高于Ca2+處理（P＜0.05）。Ca2+和激素ABA能正向調(diào)控目的基因。

圖4 PmFPP基因在不同處理下的表達(dá)模式Fig.4 Expression of PmFPP gene under different treatments

Ca2+處理的PmGGPP基因表達(dá)量與CK 相比顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖5）。在第5天，MeJA、GA、ABA和SA 處理的PmGGPP基因表達(dá)量均顯著高于CK（P＜0.05）；從第1天開始，所有激素處理的PmGGPP基因表達(dá)量均顯著高于Ca2+處理（P＜0.05）。除Me?JA+Ca2+處理在第5天PmGGPP基因表達(dá)量高于Me?JA 處理外，其他激素+ Ca2+處理的PmGGPP基因表達(dá)量均顯著低于激素處理（P＜0.05）。Ca2+可以降低目的基因表達(dá)；MeJA、GA、ABA 和SA 激素可以緩解Ca2+對(duì)目的基因的抑制，能正調(diào)控目的基因表達(dá)。

圖5 PmGGPP基因在不同處理下的表達(dá)模式Fig.5 Expression of PmGGPP gene under different treatments

3 討論與結(jié)論

本研究獲得編碼347 和385 個(gè)氨基酸的馬尾松萜類合成途徑關(guān)鍵酶PmFPP和PmGGPP基因，序列分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因與其他物種，尤其是與針葉樹種具有高度相似性。PmFPP 具有2 個(gè)DDxxD 典型結(jié)構(gòu)域，PmGGPP 具有DDxxxxD、CxxxC 和DDxxD 典型結(jié)構(gòu)域，不同物種FPP和GGPP的典型結(jié)構(gòu)域均高度保守，說明這兩個(gè)基因在進(jìn)化過程中較為穩(wěn)定。DDxxD 結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)，是一類酶催化活性中心，在協(xié)調(diào)二價(jià)金屬離子和酶底物基團(tuán)結(jié)合時(shí)起關(guān)鍵作用[18]。但PmFPP 兩個(gè)DDxxD 在結(jié)構(gòu)上相互依賴，不能作為完全獨(dú)立的活性中心，萜類代謝途徑中的酶在轉(zhuǎn)錄水平上常呈相關(guān)性，這些酶的表達(dá)可能受同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，因此萜類代謝途徑中可能有轉(zhuǎn)錄因子存在[19-20]。

大部分FPP基因亞細(xì)胞定位于葉綠體，而PmF?PP定位于線粒體，可能是由于PmFPP 存在1 個(gè)62個(gè)氨基酸的RXXS 保守區(qū)，參與萜類化合物生物合成；PmGGPP 定位于質(zhì)體，主要合成胡蘿卜素、赤霉素、ABA 和葉綠素等物質(zhì)[21-24]。橡膠草（Taraxacumkoksaghyz）和人參（Panax ginseng）等FPP基因無跨膜結(jié)構(gòu)[25-26]。本研究中，PmFPP 和PmGGPP 基因分別有2 和4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，大多數(shù)裸子植物中的萜類合成酶家族不同于被子植物[22,27]。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建也揭示裸子植物萜類合成酶起源關(guān)聯(lián)性比被子植物更為密切，裸子植物控制樹脂合成的萜類合成酶系統(tǒng)發(fā)育樹是一個(gè)獨(dú)立分支，本研究聚類和同源序列比對(duì)結(jié)果也進(jìn)一步說明針葉樹在長(zhǎng)期演化過程中形成了獨(dú)特的防御系統(tǒng)[26]。

本研究中，與CK 相比，PmFPP和PmGGPP分別在MeJA 處理的第3天和第5天表達(dá)量上升，MeJA能誘導(dǎo)植物中單萜和二萜合成酶轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增加，提高萜類合成酶活性，促進(jìn)萜烯化合物積累[22]。MeJA 誘導(dǎo)2 天后FPP 基因才表達(dá)增加，誘導(dǎo)三萜含量增加[28]，并與萜烯類物質(zhì)作為信號(hào)分子防御外界傷害[29]，與本研究對(duì)PmFPP功能預(yù)測(cè)相同。

SA 處理下，PmFPP和PmGGPP基因與對(duì)照相比，第1 天和第5 天表現(xiàn)出較高表達(dá)量；GA 處理提高了PmFPP和PmGGPP的表達(dá)量。GA處理對(duì)黃花蒿中倍半萜含量無顯著影響[30]，MYC2通過與JA 和GA 信號(hào)途徑的因子互作來整合外源和內(nèi)源生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)協(xié)調(diào)花中單萜和倍半萜的合成與揮發(fā)[31]，結(jié)合功能預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)GA 途徑調(diào)控PmGGPP影響二萜類物質(zhì)的合成[32]。與對(duì)照和激素處理相比，Ca2+處理、激素與Ca2+處理的兩個(gè)基因表達(dá)量均下降。細(xì)胞外Ca2+螯合劑可以抑制萜類物質(zhì)誘導(dǎo)下防御基因的表達(dá)[33]，Ca2+是否通過負(fù)調(diào)控激素信號(hào)途徑參與萜類合成途徑，還有待進(jìn)一步研究。