韓寶蒼,陳志彬,張躍恒,林志芬,孫昊宇

“雞尾酒”式混合抗生素對細菌耐藥性的影響

韓寶蒼1,陳志彬1,張躍恒1,林志芬1,孫昊宇2*

(1.同濟大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,有機復(fù)合污染控制工程教育部重點實驗室,上海 200444)

選擇四環(huán)素、磺胺、磺胺增效劑3類常用抗生素,以其對大腸桿菌()的單一興奮效應(yīng)(hormesis)最大促進效應(yīng)對應(yīng)濃度(HCmax)配制等HCmax比的二元及三元混合體系,探究混合體系對細菌生長和耐藥性(突變、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移)的聯(lián)合效應(yīng).結(jié)果表明,二元混合抗生素對生長和接合轉(zhuǎn)移頻率起到協(xié)同抑制,對的突變頻率起協(xié)同刺激;三元混合抗菌劑對這三種效應(yīng)均協(xié)同抑制.因此,推測二元混合體系會導(dǎo)致毒性和耐藥性風(fēng)險同時增加;三元混合體系會導(dǎo)致毒性風(fēng)險增加、耐藥性風(fēng)險降低.

混合抗生素；細菌耐藥性；hormesis；突變；接合轉(zhuǎn)移

抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、畜禽養(yǎng)殖等行業(yè)[1].然而,目前抗生素大規(guī)模生產(chǎn)與使用導(dǎo)致大量抗生素經(jīng)由廢水排放、畜禽排泄等途徑進入環(huán)境中[2],增加細菌耐藥性發(fā)生頻率,加速固有抗性微生物和抗性基因的擴散[3].細菌耐藥性污染的傳播導(dǎo)致臨床治療中常規(guī)抗生素劑量無法抑制細菌而需要加大抗生素用量,甚至誘導(dǎo)了超級細菌的出現(xiàn),這對人類健康構(gòu)成極大危害.因此,如何控制細菌耐藥性的發(fā)生與傳播是目前亟待解決的問題.環(huán)境中細菌耐藥性污染主要以抗性基因作為媒介[4].已有文獻表明,抗性基因的產(chǎn)生和傳播往往與環(huán)境中的抗生素殘留密切相關(guān)[5].環(huán)境中抗生素濃度越大,抗性基因往往污染越嚴重.因此,有學(xué)者認為,可以通過減少抗生素使用量從源頭降低抗性基因的產(chǎn)生[6].

“雞尾酒療法”作為一種藥物使用策略,指聯(lián)合使用3種或3種以上的藥物進行治療,其可以減少單一用藥造成生物體對藥物的依賴并加強療效,在源頭上減少耐藥性的產(chǎn)生[7].因此,依照“雞尾酒療法”將低劑量抗生素混合使用,可能是臨床上保持藥效、減少細菌耐藥性的抗生素聯(lián)用手段.然而,按照“雞尾酒療法”使用抗生素后,會導(dǎo)致進入環(huán)境中的抗菌劑會以低劑量、混合的形式存在.在以往的研究中,低劑量抗生素對細菌往往會產(chǎn)生低濃度促進、高濃度抑制的雙向劑量-效應(yīng),即hormesis效應(yīng)[8].已有文獻表明,hormesis效應(yīng)在抗生素作用于大腸桿菌()、費氏弧菌等多種細菌時普遍存在[5,9].

四環(huán)素類(TCs)、磺胺增效劑類(SAPs)與磺胺類(SAs)抗生素是常見的臨床使用抗生素,對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出很好的抑菌效果.因此,本文以細菌耐藥突變、RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移表征細菌耐藥性,選擇可能作為“雞尾酒療法”配方的四環(huán)素類(3種)、磺胺增效劑類(3種)和磺胺類(1種)抗生素作為受試化合物,以經(jīng)典模式生物為受試生物,探究單一抗生素對生長與突變、接合轉(zhuǎn)移的影響;將單一抗生素的hormesis促進效應(yīng)最高的濃度點(HCmax)按等HCmax比進行二元或三元混合,探究混合抗生素對生長與突變、接合轉(zhuǎn)移的影響和機制;并與單一抗生素毒性與細菌耐藥性進行對比,借鑒獨立作用(IA)模型,判別單一抗生素在等HCmax比進行混合時對生長及耐藥性的聯(lián)合作用方式.本文旨在探究抗生素“雞尾酒”暴露體系對細菌毒性與耐藥性的影響,為實際環(huán)境中低濃度抗生素的聯(lián)合作用和風(fēng)險評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與生物

實驗所用抗生素購自 Sigma-Aldrich 化學(xué)制品有限公司(上海,中國),純度為95%以上.受試化合物的基本信息見表1.購于 Biovetor 生物科技有限公司(北京,中國).毒性及突變實驗所用生物為野生型MG1655.接合轉(zhuǎn)移實驗所用供體菌是(RP4),其RP4質(zhì)粒上攜帶有卡那霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因,受體菌是具有能夠穩(wěn)定遺傳的萘啶酮酸(Nal)耐藥標記的(Nal).

表1 抗生素信息及單一毒性

1.2 毒性實驗

精確稱取測試抗生素,使用二甲基亞砜(DMSO)助溶,隨后用質(zhì)量分數(shù)為1%的氯化鈉溶液稀釋成等對數(shù)濃度梯度的系列溶液.取80μL稀釋后的化合物溶液加入到100孔板中,同時加入80μL培養(yǎng)基及40μL稀釋后的菌液,每個濃度設(shè)置3個平行,設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見表3.每組實驗設(shè)置3個空白對照,操作同上,僅以80μL氯化鈉溶液代替稀釋后的抗生素溶液.于Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀(Multiskan GO,美國賽默飛世爾科技公司)中37℃震蕩培養(yǎng),第22h測試并記錄600nm處的光密度值(OD600)的讀數(shù).

抗生素對的生長促進率由式(1)計算得出:

式中:HP表示抗生素對的生長促進率,OD600,0表示空白對照組的OD600值,OD600,表示各個實驗組的OD600值.

1.3 突變實驗

突變實驗的培養(yǎng)條件與毒性實驗相同.將含有溶液的100孔板在Bioscreen分析儀中于37℃培養(yǎng)22h后,取20μL稀釋106倍的菌液加至不含任何抗生素的固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫靜置培養(yǎng)12h后,進行菌落形成單位(CFU)計數(shù),計算總菌數(shù).另取20μL濃縮3倍的菌液加至含有40mg/L利福平的固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫靜置培養(yǎng)12h后進行突變子CFU計數(shù).對照組與實驗組每個濃度點均設(shè)置3個平行.設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見表3.

抗生素對的突變頻率促進率的由式(2)、式(3)計算得出:

式中:為突變頻率;m為突變子個數(shù),CFU/mL;t為總菌數(shù),CFU/mL;

式中:MP為抗生素對的突變頻率促進率;i和c分別為實驗組和對照組突變頻率.

表2 實驗設(shè)置濃度組數(shù)及范圍

1.4 接合轉(zhuǎn)移實驗

將RP4質(zhì)粒供體菌與受體菌分別接種至含有相應(yīng)抗生素的單倍LB培養(yǎng)基中,在37℃條件下以180r/min振蕩培養(yǎng)9h,用同樣體積的生理鹽水進行2次洗菌,去除多余的培養(yǎng)基及抗生素,調(diào)節(jié)其OD600值為0.5左右,再以供體菌:受體菌=1:2的比例混合制成工作菌液.

配置200μL的培養(yǎng)體系,其中包含40μL的單一或混合抗生素溶液、100μL的培養(yǎng)基和60μL的工作菌液,混勻后靜置培養(yǎng)8h.之后進行梯度稀釋,分別取稀釋后的菌液30μL添加至含有萘啶酮酸和卡那霉素的篩選板上,37℃靜置培養(yǎng)12h后分別進行接合子CFU計數(shù)與受體菌CFU計數(shù).對照組與實驗組均設(shè)置3個平行.設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見表3.

抗生素對E. coli的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進率由式(4)、式(5)計算得出:

式中:為RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率;c為接合子個數(shù), CFU/mL;r為受體菌個數(shù),CFU/mL;

式中:RP為抗生素對E. coli的RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進率;i和c分別為實驗組和對照組的RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率.

表3 化合物混合液中各抗生素的比例和濃度值

注:“-”表示無數(shù)據(jù).

1.5 特征參數(shù)表征

抗生素對的毒性效應(yīng)曲線如圖1a所示.根據(jù)單一抗生素的毒性實驗結(jié)果,當生長抑制率達到50%時,在圖1a上對應(yīng)濃度為EC50; HPmax在圖1a上對應(yīng)的濃度為HCmax.混合抗生素濃度為HCmix在圖1a上對應(yīng)的生長促進率為HPmix.

圖1 抗生素對E. coli的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)曲線

抗生素對的突變效應(yīng)曲線如圖1b所示.單一抗生素MPmax在圖1b上對應(yīng)濃度為MCmax.單一抗生素處于HCmax濃度時在圖1b上對應(yīng)的突變促進率為MP-HCmax.混合抗生素處于HCmix時在圖1b上對應(yīng)的突變促進率為MP-HCmix.

抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)曲線如圖1c所示.單一抗生素RPmax圖1c上對應(yīng)的濃度為RCmax.單一抗生素處于HCmax濃度時在圖1c對應(yīng)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率為RP-HCmax.混合抗生素處于HCmix時在圖1c上對應(yīng)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率為RP-HCmix.

本文涉及到的生長、突變與接合轉(zhuǎn)移指標參數(shù)及其具體釋義在表4中列出.

1.6 聯(lián)合作用判別

混合暴露實驗中,由于TCs與SAs、SAPs作用通路不同,基于IA模型對混合抗生素的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)的聯(lián)合作用方式進行判別.

基于IA模型的判別方法,構(gòu)造式(6)計算理論毒性效應(yīng)HPmix-IA.

式中:HPmax(i)是第種抗生素單一暴露時產(chǎn)生的hormesis最大促進效應(yīng).將混合抗生素實際的HPmix與計算得到的HPmix-IA進行比較,當實際的HPmix小于HPmix-IA時,認為混合抗生素對的生長抑制起到協(xié)同作用;當實際的HPmix等于HPmix-IA時,認為混合抗生素對的生長抑制起到相加作用;當實際的HPmix大于HPmix-IA時,認為混合抗生素對的生長抑制起到拮抗作用.

相應(yīng)地,構(gòu)造式(7)計算理論突變效應(yīng)MP- HCmix-IA.

式中:MP-HCmax(i)是第種抗生素單一暴露時在HCmax濃度處的突變頻率促進率.將混合抗生素實際的MP-HCmix與計算得到的MP-HCmix-IA進行比較,當實際的MP-HCmix小于MP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的突變促進效應(yīng)起到拮抗作用;當實際的MP-HCmix等于MP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的突變促進效應(yīng)起到相加作用;當實際的MP-HCmix大于MP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的突變促進效應(yīng)起到協(xié)同作用.

此外,構(gòu)造式(8)計算理論接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)RP- HCmix-IA.

式中:RP-HCmax(i)是第種抗生素單一暴露時在HCmax濃度處的接合轉(zhuǎn)移頻率促進率.將混合抗生素實際的RP-HCmix與計算得到的RP-HCmix-IA進行比較,當實際的RP-HCmix小于RP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進效應(yīng)起到拮抗作用;當實際的RP-HCmix等于RP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進效應(yīng)起到相加作用;當實際的RP-HCmix大于RP-HCmix-IA時,認為混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進效應(yīng)起到協(xié)同作用.

表4 E. coli生長與突變、接合轉(zhuǎn)移指標參數(shù)釋義

2 結(jié)果與討論

2.1 單一抗生素對E. coli的生長及耐藥性的影響

2.1.1 單一抗生素對生長的影響 單一抗生素對生長的EC50見表1,各抗生素毒性大小順序為:SDX < OH < OMP < DVD < DH < TH < TMP.在實驗濃度范圍內(nèi),所有單一抗生素均對的生長表現(xiàn)出hormesis效應(yīng), hormesis效應(yīng)的HPmax與HCmax數(shù)據(jù)見表5,其中HPmax的大小順序為TH < DVD < TMP < OH < DH < OMP < SDX;HCmax的大小順序為TH < TMP < DH < DVD < OH < SDX < OMP.依據(jù)現(xiàn)有文獻報道,TCs、SAs、SAPs抑制生長的機制如下(圖2a):TCs經(jīng)由細胞外膜的親水性孔,通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進入細胞,與核糖體30S亞基16s RNA上的A位點結(jié)合,阻止氨基酰-tRNA進入核糖體,從而抑制肽鏈延長與蛋白質(zhì)合成[10];SAs與對氨基苯甲酸(PABA)競爭結(jié)合二氫蝶酸合成酶(DHPS),阻礙二氫葉酸(DHF)的合成,進而抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)與DHF的結(jié)合[11-12],阻礙四氫葉酸(THFA)的合成,最終抑制的生長[13];SAPs作用通路與SAs相似,SAPs通過與DHF競爭結(jié)合DHFR從而阻礙THFA合成,抑制生長[14-15].以往的研究表明,活性氧簇(ROS)在抗生素抑制細菌生長的過程中也起重要作用.ROS在低濃度抗生素下對細菌起到保護作用,而在高濃度抗生素下則協(xié)同抗生素抑菌[16].因此推測,當暴露于抗生素時,低劑量抗生素會引起ROS水平輕微升高,使ROS扮演信號分子的角色,調(diào)控的相關(guān)通路從而引起生長促進作用[17],最終表現(xiàn)出hormesis劑量-效應(yīng)關(guān)系.

2.1.2 單一抗生素對突變的影響 單一抗生素均能促進的突變效應(yīng),其對應(yīng)的MPmax與MCmax見表5.其中各抗生素MPmax的大小順序為SDX < DH < TH < OH < TMP < OMP < DVD;MCmax的大小順序為OH < TH < TMP < DH < OMP < SDX < DVD.基于以往的研究,推測TCs、SAs、SAPs促進突變頻率的可能機制如下(圖2b):對TCs的耐藥性是由16S rRNA基因?qū)?yīng)位點上AGA926-928發(fā)生單或多堿基突變引起,該區(qū)域在核糖體螺旋環(huán)31(helix31)處,是TCs與16S rRNA主要的結(jié)合位點[18]; helix31區(qū)域的核苷酸突變會影響16S rRNA與TCs的親和力,從而使對TCs產(chǎn)生耐藥性[19].SAs、SAPs阻礙THFA生物合成,從而減少嘌呤與嘧啶的合成,在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄時,可能會導(dǎo)致堿基的錯配,并最終促進的突變頻率[20].此外,當TCs、SAPs、SAs濃度超過閾值時,抗生素對產(chǎn)生明顯的生長毒性,致使細菌總數(shù)與突變體數(shù)量大幅下降,進而導(dǎo)致各抗生素對突變頻率促進作用的下降[21].

表5 單一抗生素毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)相關(guān)參數(shù)匯總

圖2 SAs、SAPs、TCs的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移作用通路 [15,20,24]

PABA,對氨基苯甲酸;DHPS,二氫蝶酸合成酶;DHF,二氫葉酸;DHFR,二氫葉酸還原酶;THFA,四氫葉酸

2.1.3 單一抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 單一抗生素均能促進的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng),其對應(yīng)的RPmax與RCmax見表5.其中,各抗生素RPmax的大小順序為SDX < DVD < TMP < OMP < DH < TH < OH; RCmax的大小順序為OMP < DVD < TMP < SDX < DH < OH < TH.TCs、SAPs、SAs促進的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率的可能機制如下(圖2c):暴露在TCs藥物中含有RP4質(zhì)粒的供體菌,可以通過特異性識別RP4質(zhì)粒上的序列[22],促使閉合環(huán)狀DNA雙鏈進行解螺旋[23],質(zhì)粒上的R,A,1和2等基因得以表達,從而促進質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移.當TCs濃度達到一定閾值時,抗生素對供體菌與受體菌產(chǎn)生明顯的生長毒性,致使接合子數(shù)量大幅下降,進而導(dǎo)致TCs對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進作用的下降.SAPs、SAs的暴露可引起體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)損傷,觸發(fā)SOS反應(yīng)[24-25]. SOS反應(yīng)可能上調(diào)RP4質(zhì)粒編碼基因,以及控制供體和受體細菌細胞膜通透性的基因,從而促進RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移[26-27].當SAPs、SAs脅迫逐漸增大,SOS反應(yīng)不能完全修復(fù)DNA與蛋白質(zhì)損傷,可能影響供體與受體菌活性,甚至是接合子活性,導(dǎo)致SAPs、SAs對接合轉(zhuǎn)移頻率的促進作用逐漸降低[28-30].

2.2 二元及多元抗生素混合對E. coli的生長及耐藥性的影響

2.2.1 混合抗生素對生長的影響 根據(jù)單一抗生素毒性實驗結(jié)果,將3類抗生素按照等HCmax濃度比進行混合,毒性效應(yīng)結(jié)果如圖3所示.在圖3中利用虛線表征當單一抗生素以濃度HCmax混合時的混合抗菌劑濃度HCmix,找到其對應(yīng)的生長促進率HPmix,可以看出:TH&SDX組合的HCmix虛線落在無效應(yīng)區(qū)間內(nèi),表示TH&SDX二元混合在HCmix對無毒性效應(yīng);其余5種組合的HCmix垂線均落在促進率為負的區(qū)間范圍(即抑制區(qū)間范圍)內(nèi),表示該5種組合在HCmix對的生長有抑制效應(yīng),且抑制率均達到80%以上,說明混合抗生素能夠明顯抑制的生長.為進一步明確混合抗生素對生長的聯(lián)合作用方式,計算得到IA模型下混合抗生素的HPmix-IA,并與實際HPmix進行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見表6.二元混合抗生素和三元混合抗生素的HPmix均小于HPmix-IA,說明混合抗生素對的生長抑制起到協(xié)同作用.由單一抗生素對的毒性作用機制可以看出(圖2),SAs、SAPs分別與DHPS、DHFR結(jié)合后,會抑制THFA的合成[31].當阻斷THFA的合成時,氨基酸甲酰化受到阻礙,從而使核蛋白的合成受阻.同時,TCs與核糖體30S亞基16s RNA上A位點結(jié)合,阻止氨基酰-tRNA進入核糖體A位置,抑制肽鏈延長和蛋白質(zhì)合成[14].因此,TCs與SAs、SAPs的聯(lián)用能夠共同抑制蛋白質(zhì)合成,對的生長抑制起到協(xié)同作用.

表6 混合抗生素毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)的實際與計算促進率

圖3 混合抗生素對E. coli生長的毒性效應(yīng)

2.2.2 混合抗生素對突變的影響 如圖4所示, 利用虛線表征當單一抗生素以濃度HCmax混合時的混合抗生素濃度HCmix,找到其對應(yīng)的突變頻率促進率MP-HCmix,可以看出:混合抗生素依然能夠促進突變的產(chǎn)生.為進一步明確混合抗生素對突變的聯(lián)合作用方式,計算得到IA模型下混合抗生素的MP-HCmix-IA,并與實際MP-HCmix進行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見表6.二元混合抗生素的MP- HCmix均大于MP-HCmix-IA,說明二元混合抗生素對促進突變頻率起到協(xié)同作用;三元混合抗生素的MP-HCmix均小于MP-HCmix-IA,說明三元混合抗生素對促進的突變頻率起到拮抗作用.由單一抗生素對的突變作用機制可以看出(圖2),TCs造成16S rRNA上helix31區(qū)域的核苷酸突變;SAs、SAPs阻礙THFA生物合成,減少嘌呤與嘧啶合成,導(dǎo)致堿基錯配.TCs&SAs及TCs&SAPs的二元協(xié)同是核苷酸突變與堿基錯配共同作用的結(jié)果;SAs&SAPs的二元協(xié)同則是在于其均可阻礙THFA合成并最終導(dǎo)致堿基錯配從而起到協(xié)同作用.然而,當加入第3種抗生素時,三元聯(lián)合對的生長起到明顯抑制作用,影響細菌核酸和氨基酸的生成,導(dǎo)致突變所需要的蛋白供給減少,進而抑制的突變頻率上升.

2.2.3 混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 如圖5所示, 利用虛線表征當單一抗生素以濃度HCmax混合時的混合抗生素濃度HCmix,找到其對應(yīng)的接合轉(zhuǎn)移頻率促進率RP-HCmix,可以看出: TH&SDX組合的HCmix虛線落在接合轉(zhuǎn)移頻率促進率促進區(qū)間,表示TH&SDX二元混合在此濃度下促進的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生;其余5種組合的HCmix垂線均落在接合轉(zhuǎn)移頻率促進率抑制區(qū)間,表示該5種組合此濃度下可抑制的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生.為進一步明確混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的聯(lián)合作用方式,計算得到IA模型下混合抗生素的RP-HCmix-IA,并與實際RP-HCmix進行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見表6.二元抗生素與三元抗生素的RP-HCmix均小于RP-HCmix-IA,說明以上組合對促進的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率均起到拮抗作用.由單一抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移作用機制可以看出(圖2):TCs使供體菌RP4質(zhì)粒解螺旋,R,A,1和2基因表達,促進質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移;SAs、SAPs觸發(fā)SOS反應(yīng),上調(diào)胞內(nèi)基因,促進RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.當混合抗生素濃度處于HCmix時,低濃度抗生素聯(lián)用使細菌總數(shù)減少,從而影響供體和受體細菌的活性,甚至是結(jié)合子的活性,使TCs解螺旋的RP4質(zhì)粒減少,SOS上調(diào)胞內(nèi)基因減少,從而使RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率降低[32],表現(xiàn)為混合抗生素對的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進的拮抗作用.

圖4 混合抗生素對E. coli的突變效應(yīng)

2.3 基于“雞尾酒”暴露體系的混合抗生素的可能環(huán)境風(fēng)險

二元混合抗生素處于HCmix濃度時,實際生長促進率HPmix小于計算生長促進率HPmix-IA,實際突變促進率MP-HCmix大于計算突變促進率MP- HCmix-IA,表示對的生長抑制與突變頻率上升起到協(xié)同作用;實際質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率RP-HCmix小于計算質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率RP-HCmix-IA,表示對接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用.三元混合抗生素處于HCmix濃度時,實際生長促進率HPmix小于計算生長促進率HPmix-IA,表示對的生長抑制起到協(xié)同作用;實際突變促進率MP-HCmix小于計算突變促進率MP-HCmix-IA,實際質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率RP-HCmix小于計算質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進率RP- HCmix-IA,表示對的突變頻率上升與接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用.上述結(jié)果表明,二元與三元混合抗生素對細菌的毒性都增加,但是抗生素種類的增加能夠抑制細菌耐藥突變與質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生.因此,由上述混合抗生素實際與計算的毒性、突變、RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)大小比較,推測環(huán)境中基于“雞尾酒”暴露體系的混合抗生素(3種或3種以上),會增加生物的毒性風(fēng)險,但卻能夠降低耐藥性風(fēng)險.發(fā)現(xiàn)同時包含TC與SAP的三元混合方式較其他三元混合方式具有更明顯的“毒性風(fēng)險增加、細菌耐藥性風(fēng)險降低”的環(huán)境影響.

本文研究結(jié)果表明,一定程度上增加抗生素混合種類,會增加毒性風(fēng)險,但卻能夠降低細菌耐藥性風(fēng)險.可能原因在于混合抗生素中抗生素種類的增加,使抗生素作用于更多靶蛋白,這些靶蛋白可能處于同一條信號通路,使得對這一通路的抑制性更好,共同抑制細菌生長,放大抑制效果,增加毒性協(xié)同,從而增加毒性風(fēng)險.由于混合抗生素毒性增強,影響細菌核酸和氨基酸的生成,導(dǎo)致突變所需要的蛋白供給減少,進而抑制的突變頻率上升.混合抗生素使細菌總數(shù)減少,影響供體和受體細菌的活性,甚至是結(jié)合子的活性,從而使RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移數(shù)減少,抑制的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率上升,減少細菌耐藥性風(fēng)險[33].

此外,本研究還說明混合抗生素的毒性風(fēng)險與細菌耐藥性風(fēng)險似乎無法同時降低,毒性風(fēng)險與細菌耐藥性風(fēng)險同時降低的目的可能需要通過新型抗生素的替代使用來達到.另一方面,本文發(fā)現(xiàn)即使是在抗生素多重混合使用的情況下,其對于生長、耐藥突變與RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的促進作用區(qū)間始終存在,這表明環(huán)境中多種抗生素的殘留帶來的生態(tài)風(fēng)險仍然不可忽視.在今后的研究中,需要關(guān)注環(huán)境中抗生素暴露的濃度和種類,以及抗生素與新型抗生素混合對細菌生長與耐藥性的影響.

3 結(jié)論

3.1 在HCmix時二元混合雖能夠有效抑制的生長,但卻促進細菌耐藥性的發(fā)生.

3.2 三元混合對生長抑制起到協(xié)同作用,對耐藥突變頻率上升與接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用,其中TCs&SAPs&其他測試抗生素的三元混合方式具有更明顯的“毒性風(fēng)險增加、細菌耐藥性風(fēng)險降低”的環(huán)境效應(yīng).

3.3 基于“雞尾酒療法”使用的抗生素在進入環(huán)境后,其“雞尾酒”暴露特征可能增加毒性風(fēng)險,降低細菌耐藥性風(fēng)險,但整體上造成的生態(tài)風(fēng)險仍不容忽視.

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The effects of antibiotic mixtures on bacterial resistance based on “cocktail” exposure.

HAN Bao-cang1, CHEN Zhi-bin1, ZHANG Yue-heng1, LIN Zhi-fen1, SUN Hao-yu2*

(1.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China；2.Key Laboratory of Organic Compound Pollution Control Engineering (MOE), School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University, Shanghai 200444, China)., 2022,42(1)：434～443

Three kinds of commonly used antibiotics, i.e., tetracyclines, sulfonamides, and sulfonamide potentiators, were selected as representatives to obtain their concentration for the hormetic maximum promoting effect on() (HCmax). The binary and ternary mixtures of test antibiotics were designed based on equal HCmaxrations, and their combined effects on bacterial growth and resistance (mutation and plasmid conjugation) ofwere explored. The results showed binary mixtures synergistically inhibited the growth and conjugation frequency, but synergistically stimulated the mutation frequency. The combined effects of ternary mixtures on toxicity and resistance were all synergistic inhibition. Therefore, it could be speculated that binary mixtures might increase the risk of toxicity and resistance, while ternary mixtures might result in an increased toxicity risk but a decreased resistance risk.

antibiotic mixtures；bacterial resistance；hormesis；mutation；conjugation transfer

X171.5

A

1000-6923(2022)01-0434-10

韓寶蒼(1997-),男,山東臨沂人,同濟大學(xué)博士研究生,主要從事抗生素環(huán)境毒理研究.發(fā)表論文2篇.

2021-06-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(22006116,21777123);博士后創(chuàng)新人才支持計劃(BX20190247);中國博士后科學(xué)基金(2019M661624);上海“超級博士后”激勵計劃(2019194)

* 責(zé)任作者, 副研究員, sunhaoyu2021@shu.edu.cn