蔣偉，王鐫，任政

（1.新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，烏魯木齊 830002；2.新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院中醫(yī)科，烏魯木齊 830002）

目前，隨著全球人口老齡化以及生活節(jié)奏的加快，頸背部疼痛嚴重影響了人們的日常生活質(zhì)量，甚至導致殘疾發(fā)生，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[1-2]。而椎間盤退變是引起頸背部疼痛的主要病因，其起源于終板軟骨，終板軟骨對于椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)、代謝過程以及功能維持等方面均發(fā)揮重要作用[3]。終板軟骨由終板軟骨細胞組成，作為終板軟骨中唯一的細胞類型，其在細胞外基質(zhì)的合成與分解中起到主要的調(diào)控作用[4]，研究終板軟骨細胞行為學變化對于椎間盤退變意義重大。

桂枝加葛根湯來源于《傷寒論》，是治療太陽中風證的經(jīng)典方劑，已有研究表明，其具有鎮(zhèn)痛、減輕局部炎性腫脹的作用[5]，此外，對于薄型子宮內(nèi)膜所致的月經(jīng)過少具有良好的治療效果[6]。根據(jù)桂枝加葛根湯的改善血液流變學、擴充血管、調(diào)節(jié)平滑肌活動等藥理作用，并能夠明顯緩解神經(jīng)根型頸椎病大鼠的疼痛[7]，目前已將其運用于頸椎病、肩周炎、落枕等臨床治療當中，但其相關(guān)的作用機制尚未完全明確?；|(zhì)細胞衍生因子1（SDF-1）/CXC趨化因子受體4（CXCR4）參與炎癥反應(yīng)、癌性骨痛、術(shù)后疼痛等一系列生理生化和病理過程，關(guān)于該信號軸在椎間盤方面的作用研究也已有報道，通過阻斷SDF-1/CXCR4信號通路可促進軟骨終板細胞增殖和基質(zhì)形成，抑制軟骨終板細胞凋亡，對椎間盤退變具有一定的治療作用[8]。因此，本文通過觀察桂枝加葛根湯含藥血清對體外力學刺激誘導的大鼠椎間盤終板軟骨細胞退變中的作用，并探討其可能機制，以期在臨床用藥中更加有效的發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 健康清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)批號：SCXK（新）2018-0002，本研究獲得醫(yī)院動物倫理委員會的批準。Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司，胎牛血清與DMEM/F12培養(yǎng)液購自美國 Gibco公司，CCK-8試劑盒、BCA試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海碧云天公司，鬼筆環(huán)肽試劑購自上海翊圣生物公司，化學發(fā)光液ECL、甲苯胺藍試劑和免疫熒光染色試劑購自北京索萊寶生物公司，Trizol試劑、cDNA試劑盒與SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒購自日本TaKaRa公司，BioFlex TM 6孔板購自美國 Flexcell公司，抗體CXCR4、COL2A1、SOX9、GAPDH 購自英國 Abcam公司，HRP標記山羊抗兔購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 大鼠終板軟骨細胞的分離培養(yǎng) 參考文獻[9]方法分離大鼠終板軟骨細胞，取5只健康清潔級SD大鼠，處死后使用75%乙醇全身消毒，并在無菌條件下取出胸腰段脊柱，剔除附著韌帶與其他組織，分離終板軟骨，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，并剪成碎片，加入0.25%的胰蛋白酶消化30 min，接著加入0.3%Ⅱ型膠原酶消化1 h。收集懸液，以1 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心5 min，去消化液，PBS清洗后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，接種于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，待細胞融合度達到80%以上時，按1∶3的比例進行傳代。本研究使用第3代軟骨細胞進行實驗。

1.3 桂枝加葛根湯含藥血清制備 桂枝加葛根湯按《傷寒論》原方（葛根 12 g，桂枝 9 g，芍藥 9 g，生姜 9 g，甘草 6 g，大棗 12枚，麻黃 9 g）比例制備成0.5 g/mL的濃縮液，具體操作為：加水浸泡藥物30 min，文火分別煎熬40 min和30 min，將兩次的煎液混合后，以4 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心10 min，取濃縮的上清液，并保存于4℃冰箱。取10只SD大鼠，參考文獻[10]方法給藥，每只以4 mL的桂枝加葛根湯灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4 d，在末次灌胃2 h后，給予乙醚吸入麻醉，通過腹主動脈及心臟采血，分離血清，保存于-20℃冰箱。

1.4 大鼠終板軟骨細胞體外力學誘導退變模型建立與處理 參考文獻[11]方法誘導大鼠終板軟骨細胞退變模型，取生長狀態(tài)良好的終板軟骨細胞，調(diào)整細胞密度以1×105個/孔接種至Ⅰ型膠原覆蓋處理的6孔BioFlexTM加力板上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%以上時，將細胞隨機分為4組進行實驗：對照組、模型組、桂枝加葛根湯組、桂枝加葛根湯+SDF-1α組。桂枝加葛根湯組細胞在力學刺激前使用制備的桂枝加葛根湯含藥血清處理細胞24 h，桂枝加葛根湯+SDF-1α組細胞使用桂枝加葛根湯含藥血清和含100 μg/L SDF-1α無血清培養(yǎng)液處理細胞24 h。除對照組外，其余各組細胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)通過Flexcell FX-5000TM細胞應(yīng)力加載系統(tǒng)給予力學刺激（0.5 Hz，10%伸長率，8 h/d），過程中對照組細胞正常培養(yǎng)，不進行任何處理。

1.5 CCK-8法檢測終板軟骨細胞活性 收集處理后的各組終板軟骨細胞，按1×105個/孔的密度接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，采用酶標儀測定波長450 nm處吸光度值，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。

1.6 流式細胞術(shù)檢測終板軟骨細胞凋亡 收集處理后的各組終板軟骨細胞，將細胞消化離心后，使用Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細胞，再在細胞懸浮液中加入5 μL的Annexin V-FITC輕輕混勻，接著加入10 μL的碘化丙啶染色液，在25℃室溫下避光孵育30 min，通過流式細胞儀檢測細胞染色情況，利用Flow JO軟件分析終板軟骨細胞的凋亡情況，實驗獨立重復(fù)3次。

1.7 細胞染色 1）甲苯胺藍染色檢測終板軟骨細胞形態(tài)變化：收集處理后的各組終板軟骨細胞，調(diào)整密度為2×104個/mL，取100 μL鋪在裝有蓋玻片的6孔板中，當細胞融合達到80%～90%時，移去蓋玻片，將細胞采用4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗，每孔加入2 mL 1%甲苯胺藍染色1 h，洗去多余染料，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。2）鬼筆環(huán)肽染色檢測終板軟骨細胞形態(tài)變化：將各組細胞使用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS清洗，加入0.3%Triton X-100透膜處理10 min，接著添加100 μL鬼筆環(huán)肽溶液，在室溫下避光孵育1 h，棄去溶液并使用PBS緩沖液清洗，添加100 μL DAPI，室溫下避光孵育5 min，PBS再次清洗后，采用激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞中F-actin變化并拍照。3）免疫熒光染色檢測終板軟骨細胞CXCR4表達：將各組細胞使用4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS清洗，滴加0.3%TritonX-100透膜處理10 min，加入10%山羊血清室溫封閉2 h后，滴加CXCR4（1∶200）一抗，4℃下孵育過夜，次日棄去一抗，滴加熒光二抗，室溫避光孵育1 h后，PBS再次清洗，滴加DAPI室溫染色10 min，PBS洗滌后封片，在熒光顯微鏡下觀察CXCR4陽性表達并拍照。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測終板軟骨細胞COL2A1、SOX9蛋白表達 收集處理后的各組終板軟骨細胞，加入RIPA緩沖液裂解細胞，4℃下以12 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集上清，BCA試劑盒測定提取蛋白濃度。取50 μg蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST溶液清洗膜后，加入稀釋的一抗COL2A1（1∶1 000）、SOX9（1∶1 000），在 4 ℃下孵育過夜，TBST 溶液清洗膜，加入稀釋的HRP標記山羊抗兔（1∶5 000）為二抗，室溫孵育1 h，TBST再次洗膜后，滴加發(fā)光液ECL，凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，Quantity-One軟件分析蛋白含量，并以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.9 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測終板軟骨細胞COL2A1、SOX9 mRNA表達 收集處理后的各組終板軟骨細胞，使用Trizol試劑提取各處理組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度與純度。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒說明進行qRT-PCR反應(yīng)，以β-Actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，循環(huán)1次；95℃變性20s，60℃退火15s，72℃延伸45s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量，實驗重復(fù)3次。引物序列如下：COL2A1上游引物5'-CCTGAAACTCTGCCACCCAG-3'，下游引物 5'-GTTCTTCCGAGGCACAGTCG-3'；SOX9 上游引物5'-ATCTGAAGAAGGAGAGCGAG-3'，下游引物5'-TCAGAAGTCTCCAGAGCTTG-3'；β-actin 上游引物5'-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCT-A-3'，下游引物5'-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3'。

1.10 統(tǒng)計學方法 本研究實驗結(jié)果采用SSPS23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性檢驗采用Levene檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 桂枝加葛根湯對力學刺激下終板軟骨細胞增殖活性的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示，在24、48、72 h時，力學刺激下的模型組終板軟骨細胞增殖活性較對應(yīng)時間點的對照組細胞增殖活性均顯著下降（P<0.05）；與模型組比較，桂枝加葛根湯組細胞增殖活性顯著升高（P<0.05），而桂枝加葛根湯+SDF-1α組與模型組各時間點的增殖活性均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見表1。

表1 各時間點下各組終板軟骨細胞吸光度值比較（±s）Tab.1 Comparison of the absorbance values of endplate chondrocytes in each group at each time point（±s）

表1 各時間點下各組終板軟骨細胞吸光度值比較（±s）Tab.1 Comparison of the absorbance values of endplate chondrocytes in each group at each time point（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別 n 12 h 24 h 48 h 72 h對照組 3 0.27±0.02 0.48±0.05 0.75±0.07 1.00±0.09模型組 3 0.26±0.03 0.30±0.03*0.42±0.04*0.53±0.05*桂枝加葛根湯組 3 0.30±0.03 0.44±0.04#0.69±0.07#0.89±0.09#桂枝加葛根湯+SDF-1α 組 3 0.28±0.03 0.31±0.02 0.41±0.04 0.54±0.06

2.2 桂枝加葛根湯對力學刺激下終板軟骨細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，模型組終板軟骨細胞凋亡率較對照組顯著增加（P<0.05）；桂枝加葛根湯組細胞凋亡率較模型組顯著減少（P<0.05），同時，桂枝加葛根湯+SDF-1α組與模型組的細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測各組終板軟骨細胞凋亡情況（±s）Fig.1 Flow cytometry detection of endplate chondrocyte apoptosis in each group（±s）

2.3 桂枝加葛根湯對力學刺激下終板軟骨細胞形態(tài)變化的影響 甲苯胺藍染色后細胞核被染成深藍色，細胞質(zhì)被染成藍色。對照組終板軟骨細胞較短，細胞分布均勻，細胞核清晰，細胞外基質(zhì)染色明顯。模型組細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈紡錘形，細胞核邊界不清晰，細胞基質(zhì)染色程度較輕。桂枝加葛根湯組細胞形態(tài)有所恢復(fù)，邊界較為清楚，而桂枝加葛根湯+SDF-1α組細胞形態(tài)變化與模型組相似。見圖2。

圖2 甲苯胺藍染色觀察各組終板軟骨細胞形態(tài)變化（×100）Fig.2 Toluidine blue staining to observe the morphological changes of endplate chondrocytes in each group(×100)

此外，鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，對照組終板軟骨細胞呈多邊形，模型組和桂枝加葛根湯+SDF-1α組細胞形態(tài)發(fā)生改變，由多邊形變?yōu)榧忓N狀，可見細胞骨架明顯拉長。桂枝加葛根湯組細胞形態(tài)有所恢復(fù)，細胞骨架拉伸較模型組縮短。見圖3。

圖3 鬼筆環(huán)肽染色觀察各組終板軟骨細胞形態(tài)變化（×200）Fig.3 Phalloidin staining to observe the morphological changes of endplate chondrocytes in each group(×200)

2.4 桂枝加葛根湯對力學刺激下終板軟骨細胞中CXCR4表達的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組終板軟骨細胞中CXCR4陽性熒光表達較弱，模型組細胞中CXCR4陽性熒光表達較對照組明顯增強。與模型組比較，桂枝加葛根湯組CXCR4陽性熒光表達明顯減弱，而桂枝加葛根湯+SDF-1α組CXCR4陽性熒光表達與模型組比較，CXCR4陽性熒光表達無明顯差異。見圖4。

圖4 免疫熒光染色檢測各組終板軟骨細胞中CXCR4表達（×100）Fig.4 Immunofluorescence staining to detect the expression of CXCR4 of endplate chondrocytes in each group(×100)

2.5 桂枝加葛根湯對力學刺激下終板軟骨細胞中COL2A1、SOX9 mRNA與蛋白表達的影響 qRTPCR和Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組終板軟骨細胞中COL2A1、SOX9在mRNA與蛋白表達水平上均顯著下降（P<0.05）。與模型組比較，桂枝加葛根湯組細胞中COL2A1、SOX9 mRNA與蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05），而桂枝加葛根湯+SDF-1α組與模型組細胞中的COL2A1、SOX9 mRNA與蛋白的相對表達量無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見圖5與圖6。

圖5 qRT-PCR檢測各組終板軟骨細胞中COL2A1、SOX9 mRNA表達水平（±s）Fig.5 qRT-PCR detection of COL2A1 and SOX9 mRNA expression levels of endplate chondrocytes in each group（±s）

圖6 Western blot檢測各組終板軟骨細胞中COL2A1、SOX9蛋白表達水平（±s）Fig.6 Western blot detection of COL2A1 and SOX9 protein expression levels of endplate chondrocytes in each group（±s）

3 討論

椎間盤退變被認為是導致慢性椎間盤源性下背痛和坐骨神經(jīng)痛的主要原因，嚴重影響著患者的生活質(zhì)量[2]。椎間盤是由髓核、纖維環(huán)和終板軟骨組成的無血管組織，軟骨終板是椎間盤和椎骨之間的一層薄薄的透明橋接物，不僅允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物通過椎骨血管，而且能夠分散椎間盤之間的壓力以提供生物力學支持[12]。目前，關(guān)于軟骨終板和椎間盤之間的相互作用關(guān)系已經(jīng)開展了較多的研究。Rade等[13]通過大量的人群調(diào)查結(jié)果顯示，腰椎椎間盤水平上的終板缺損均與椎間盤退變成顯著且獨立相關(guān)性。Xiao等[14]通過磁共振成像的研究報道指出，終板凹角和終板Modic改變引起的終板變化與椎間盤退變程度呈正相關(guān)。因此，終板軟骨細胞退變可能是與椎間盤退變直接相關(guān)的主要病理學基礎(chǔ)之一，這對于椎間盤退變的診治提供了潛在的治療靶點。然而，對于介導治療終板軟骨的特定分子機制目前仍知之甚少。

終板軟骨組織變性會阻礙養(yǎng)分的輸送并影響機械轉(zhuǎn)導，而營養(yǎng)供應(yīng)的減少在椎間盤退變的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[3]。Wong等[15]證明了終板軟骨組織成分極大地影響了髓核細胞的存活和功能發(fā)揮，其缺乏后阻止了溶質(zhì)的通過并阻礙了正常的營養(yǎng)供應(yīng)，這也可能阻礙了椎間盤退變治療過程中的一些措施。Zehra等[16]提出營養(yǎng)不足會損害椎間盤對增加負荷或受傷的反應(yīng)能力，并使椎間盤易變性。此外，終板軟骨變性可能使炎癥細胞因子的分泌增加和基質(zhì)降解酶的基因表達，從而誘發(fā)椎間盤退變[17]。提高終板軟骨的抗應(yīng)力性可能是延遲或逆轉(zhuǎn)終板軟骨退變并有效治療椎間盤退變的關(guān)鍵。然而，終板軟骨細胞對張力刺激非常敏感，低強度和低頻率的拉伸張力下已證明終板軟骨細胞具有一定的抗炎功能，有助于表型軟骨基因的表達和細胞外基質(zhì)的合成[18-19]。相反，高強度和高頻率的拉伸張力會抑制軟骨形成并引起降解[20]。本研究結(jié)果顯示，體外力學刺激下的終板軟骨細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，由多邊形被拉長為紡錘形，細胞增殖活性下降，同時也促進了細胞凋亡的發(fā)生。而經(jīng)過桂枝加葛根湯含藥血清預(yù)先處理的細胞形態(tài)改變程度較輕，細胞增殖活性有所升高，并抑制了細胞的凋亡。由此說明，桂枝加葛根湯含藥血清對終板軟骨細胞退變起到了一定的改善作用。

SOX9是軟骨形成所必需的轉(zhuǎn)錄因子，并且在軟骨細胞分化過程中的各個階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOX9能夠抑制軟骨細胞向肥大性軟骨細胞的轉(zhuǎn)化，從而阻止軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生[21]。已有研究證明了SOX9與椎間盤之間的相關(guān)性，SOX9的缺失或減少會引發(fā)終板軟骨的變性從而導致椎間盤退變，SOX9的過表達可顯著延遲椎間盤退變的發(fā)生，表明SOX9在椎間盤退變進程中具有保護作用，能夠增加軟骨細胞外基質(zhì)聚集蛋白聚糖和膠原II的表達[22-23]。在本研究中，經(jīng)過桂枝加葛根湯含藥血清預(yù)先處理的細胞中COL2A1與SOX9的表達水平較模型組明顯增加，進一步說明了桂枝加葛根湯對體外力學刺激誘導的大鼠終板軟骨細胞退變的影響作用。

但是，終板軟骨退變的機制十分復(fù)雜，對于在退變過程中發(fā)揮積極作用的關(guān)鍵分子如SOX-9的基本調(diào)控機制尚不清楚，導致SOX-9啟動子發(fā)生表觀遺傳變化的特定調(diào)控途徑有待進一步研究。SDF-1是一種趨化因子，通過與7個跨膜G蛋白偶聯(lián)受體CXC趨化因子受體4型（CXCR4）結(jié)合而發(fā)揮作用。SDF-1可觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎促進軟骨細胞死亡，并能夠增加體外軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達來誘導基質(zhì)降解[24]。作為CXCR4唯一已知的配體，兩者結(jié)合并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管生成和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[25]。近年來，SDF-1/CXCR4軸在骨科疾病發(fā)病機制中的作用得到越來越多的關(guān)注。例如，SDF-1/CXCR4信號通路下調(diào)SRY-box 9和II型膠原蛋白的表達以抑制軟骨細胞的分化[26]。本研究中探究了SDF-1/CXCR4信號通路在大鼠終板軟骨細胞退變中的調(diào)節(jié)作用，通過桂枝加葛根湯聯(lián)合SDF-1α預(yù)先處理終板軟骨細胞后力學刺激細胞退變確認SDF-1/CXCR4軸參與了大鼠終板軟骨細胞退變，SDF-1α抑制了桂枝加葛根湯對大鼠終板軟骨細胞退變的改善作用。由此說明，在力學刺激下激活了SDF-1/CXCR4軸參與到細胞退變過程。

綜上所述，桂枝加葛根湯在力學刺激引起的大鼠終板軟骨退變中能夠提高細胞活性，抑制細胞凋亡，達到改善細胞退變的現(xiàn)象，這一作用可能與抑制SDF-1/CXCR4軸相關(guān)。但此過程是否涉及其他分子機制或者作用靶點，在體內(nèi)實驗中是否發(fā)揮同樣療效仍無法明確，這將是下一步進行深入研究的方向。