張毅，趙丹丹，莫芳芳，高思華

（1.北京開(kāi)放大學(xué)，北京 100081；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

2型糖尿?。═2DM）是與遺傳、環(huán)境污染、免疫、年齡、生活方式等多因素密切相關(guān)的內(nèi)分泌代謝性疾病之一，在全球的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢(shì)[1-2]。隨著人口老齡化的加劇和肥胖人群的增多，再加之巨大的人口基數(shù)，目前中國(guó)已居T2DM人數(shù)高發(fā)國(guó)家前列[3]。肝臟是人體內(nèi)參與糖類(lèi)代謝的重要器官之一，血液中的胰島素可以與肝臟胰島素受體底物-2（IRS-2）結(jié)合促進(jìn)肝臟合成糖原，減少肝糖的輸出，以降低循環(huán)系統(tǒng)中葡萄糖的含量，從而維持正常血糖水平[4]。胰島素抵抗在T2DM繼發(fā)肝臟合成糖原功能異常環(huán)節(jié)中起著非常重要的作用。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，肝臟儲(chǔ)備糖原能力降低，糖異生作用加強(qiáng)，葡萄糖輸出增多，循環(huán)系統(tǒng)中葡萄糖含量增加，T2DM患者的血糖水平升高[5-7]。

降糖消渴顆粒是以《黃帝內(nèi)經(jīng)》中關(guān)于“消渴病”病因病機(jī)的論述為理論指導(dǎo)，結(jié)合導(dǎo)師多年的臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制而成的治療糖尿病的方劑，由丹參、生地黃、黃連、茯苓、山萸肉、生曬參等10味藥組成，組方旨在肝、脾、腎3臟同調(diào)。根據(jù)糖尿病的發(fā)病特點(diǎn)，以疏肝、健脾、固腎為本，兼以清熱燥濕、益氣升陽(yáng)，臨床根據(jù)所病臟腑的先后順序靈活調(diào)整方中藥物的劑量，效果顯著[8-9]。同時(shí)，該方經(jīng)前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)具有良好的改善胰島素抵抗、降低血糖、延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病靶器官輕度損傷的作用[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)選用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠為研究對(duì)象，以高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)病，模擬人類(lèi)T2DM發(fā)病中遺傳因素、飲食不節(jié)等病因，探討降糖消渴顆粒對(duì)糖尿病小鼠肝臟糖原合成及儲(chǔ)備能力的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性8周齡KK-Ay小鼠、C57BL/6J小鼠，均由北京華阜康生物科技有限公司[許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001]提供，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 [合格證號(hào)SCXK（京）2011-0024]，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度22～24℃，相對(duì)濕度（40±10）%，12/12 h 光照/黑暗循環(huán)，飼養(yǎng)期間，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。高脂飼料（20%蔗糖、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66.5%基礎(chǔ)飼料）及普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 降糖消渴顆粒及制備方法詳見(jiàn)前期研究文獻(xiàn)[10-13]，規(guī)格：每克顆粒含5.01 g生藥。吡格列酮片由北京太洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器與試劑 光學(xué)顯微鏡（日本奧林帕斯）、Trizol試劑（美國(guó) Invitrogen公司）、SYBR Mix試劑盒（美國(guó)ABI公司）、引物設(shè)計(jì)合成（上海生物工程有限公司）、Carnoy固定液（無(wú)水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷3種試劑，配置體積比例為6∶1∶3，使用前將三者混勻，分裝入各標(biāo)記離心管中，現(xiàn)用現(xiàn)配）、50 mL過(guò)碘酸溶液（稱(chēng)取0.4 g過(guò)碘酸，加入10 mL去離子水中混合為A液，95%乙醇35 mL與0.2 mol/L醋酸鈉5 mL混合為B液，使用前將A液加入B液中充分混勻）、Schiff反應(yīng)劑（稱(chēng)取1 g堿性品紅加入盛有200 mL加熱至沸的去離子水的三角瓶中，攪拌至溶解，繼續(xù)加熱10 min，冷卻至50℃后過(guò)濾，緩緩加入20 mL濃鹽酸，冷卻至室溫后加入1 g無(wú)水偏重亞硫酸鈉，密封瓶口，室溫避光處放置2 d至成熟，4℃冰箱保存）。若有色可加入1 g活性炭后過(guò)濾使用。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥方法 KK-Ay小鼠40只，C57BL/6J小鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后給予KK-Ay小鼠高脂飼料飲食造模，C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。繼續(xù)飼養(yǎng)4周，禁食12 h后檢測(cè)KK-Ay小鼠空腹血糖，以空腹血糖≥13.9 mmol/L為糖尿病小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。將糖尿病小鼠按照血糖水平及體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組，吡格列酮組，降糖消渴顆粒高（7.00 g/kg）、中（3.50 g/kg）、低（1.75 g/kg）劑量組，每組8只。中劑量由人鼠等效劑量換算得出，高、低劑量分別是人鼠等效劑量的2倍和0.5倍。降糖消渴顆粒治療各組實(shí)驗(yàn)小鼠給予等體積，不同濃度中藥混懸液灌胃，吡格列酮組實(shí)驗(yàn)小鼠給予劑量計(jì)算方法如下：給藥劑量=6.5 mg/kg體質(zhì)量×給藥體積（0.1 mL/10 g體質(zhì)量），模型組和正常組予等體積蒸餾水灌胃。治療周期為10周，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)延續(xù)造模期間飲食模式，期間于每日上午灌胃1次。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

2.2.1 攝食量及體質(zhì)量增長(zhǎng)率檢測(cè) 給藥的0～10周期間，于每周同一時(shí)間段記錄小鼠攝食量；于第0周和第10周稱(chēng)取小鼠體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)率。公式如下：體質(zhì)量增長(zhǎng)率=（治療后體質(zhì)量-治療前體質(zhì)量）/治療前體質(zhì)量。

2.2.2 采用過(guò)碘酸雪夫染色法檢測(cè)肝臟中糖原情況 動(dòng)物麻醉后開(kāi)腹，摘取肝臟，取相同部位肝組織，放入Carnoy固定液中固定至少4 h，余下肝組織液氮保存?zhèn)溆?。固定后的肝組織梯度濃度乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后石蠟包埋、切片、烘干；梯度濃度乙醇水化，浸入過(guò)碘酸液30 min后浸入Schiff液，室溫避光，待糖原顯色后沖洗、脫水、透明后中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟糖原分布情況。通過(guò)IOD/Area值計(jì)算肝糖原含量。

2.2.3 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測(cè)肝臟糖代謝相關(guān)基因的表達(dá) IRS-2引物上游序列：5′-CCA GTA AAC GGA GGT GGC TA-3′；下游引物序列：5′-GCT TAG GGT CTG GGT TCT CC-3′。AKT-1引物上游序列：5′-ATG TGG ATC AGC GAG AGT CC-3′；下游引物序列：5′-GCA GCG GAT GAT AAA GGT GT-3′。GSK-3α 引物上游序列：5′-TCT GAG CAA GCA GGT CTG TG-3′；下游引物序列：5′-TCT AGC ACG CAC ACC AAG TC-3′。剪取 5 mm×5 mm體積肝組織，應(yīng)用Trizol法提取肝組織中的RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，將肝組織總RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA用DEPC水10倍稀釋后加入下述20 μL反應(yīng)體系中：SYBR MIX（10 μL）+c DNA 模板（2 μL）+上/下游引物（各1 μL）+無(wú)核酸酶超純水（6 μL），每組取 4 個(gè)樣本，各樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔進(jìn)行上樣。上樣后PCR膜封板，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s，40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后4℃保存。擴(kuò)增結(jié)果以Ct值表示，導(dǎo)出至EXCEL中，各樣本mRNA表達(dá)結(jié)果以樣本中β-actin的Ct值為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，得到相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用 2-ΔΔCt表示。ΔΔCt計(jì)算公式如下：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ctβactin）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ctβactin）對(duì)照組。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05表示差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Graph Pad Prism 6.0軟件繪制結(jié)果圖。

3 結(jié)果

3.1 降糖消渴顆粒對(duì)T2DM小鼠攝食量及體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響 如圖1所示，治療前，KK-Ay各組小鼠攝食量顯著高于正常組小鼠（P<0.01），組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在為期10周的治療過(guò)程中，小鼠飲食量雖無(wú)明顯增減（P>0.05），但每周都有所波動(dòng)。攝食量曲線下面積顯示，KK-Ay小鼠攝食量明顯高于正常組小鼠（P<0.01），各KK-Ay小鼠的攝食量比較無(wú)差異（P>0.05）。各治療組均未明顯影響小鼠攝食量。

圖1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠日均攝食量的影響（±s，n=8）Fig.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on daily food intake in mice of each group（±s，n=8）

如表1所示，各組小鼠體質(zhì)量在治療結(jié)束后均有所增加，KK-Ay小鼠較正常小鼠增質(zhì)量明顯（P<0.01），體質(zhì)量增長(zhǎng)率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。但各治療組小鼠增質(zhì)量情況及體質(zhì)量增長(zhǎng)率較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

表1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響（±s）Tab.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the rate of weight gain in mice of each group（±s）

表1 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響（±s）Tab.1 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the rate of weight gain in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組正常組模型組吡格列酮組降糖消渴顆粒組動(dòng)物數(shù) 劑量（g/kg）增質(zhì)量（g）8 8 8 8體質(zhì)量增長(zhǎng)率（%）- 5.17±1.16** 20.27±2.77*- 11.00±4.33 31.14±4.12 0.006 5 9.21±0.79 26.31±2.56 7.00 11.83±1.87 33.64±6.01 3.50 9.34±2.11 26.82±5.17 1.75 9.66±1.41 27.86±2.88

3.2 降糖消渴顆粒對(duì)T2DM小鼠肝臟糖原含量的影響 如圖2所示，正常小鼠肝組織致密，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，門(mén)管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列有序，包漿中均勻散布大量紫紅色糖原顆粒。KK-Ay小鼠較正常小鼠肝組織內(nèi)存在不等量脂肪性空泡，細(xì)胞形態(tài)腫脹，門(mén)管區(qū)結(jié)構(gòu)改變，肝索排列紊亂，胞漿中散在分布紫紅色肝糖原顆粒。各治療組肝臟病理改變均有不同程度減輕，降糖消渴顆粒治療各組尤為明顯。

圖2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠肝臟糖原儲(chǔ)備量的影響（PAS染色，×40）Fig.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group(PAS stain，×40)

如表2所示，KK-Ay小鼠經(jīng)藥物治療后，肝臟糖原儲(chǔ)備能力均有不同程度增強(qiáng)，但吡格列酮組和高劑量降糖消渴顆粒組小鼠與模型組比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中劑量降糖消渴顆粒作用最佳（P<0.05）。

表2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠肝臟內(nèi)糖原儲(chǔ)備量的影響（±s）Tab.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group（±s）

表2 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠肝臟內(nèi)糖原儲(chǔ)備量的影響（±s）Tab.2 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver glycogen stores in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組正常組模型組吡格列酮組降糖消渴顆粒組動(dòng)物數(shù)5 5 5 5 5 5劑量（g/kg） IOD/Area-0.25±0.06**-0.51±0.02 0.006 5 0.53±0.06 7.00 0.62±0.14 3.50 0.65±0.05*1.75 0.39±0.06

3.3 降糖消渴顆粒對(duì)T2DM小鼠肝臟調(diào)控糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 如表3所示，與正常小鼠比較，模型組小鼠肝臟 IRS-2、Akt、GSK-3α mRNA 的表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.01）；與模型組比較，吡格列酮組、高、中劑量降糖消渴顆粒組IRS-2 mRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.01），低劑量也可發(fā)揮一定作用（P<0.05）；在Akt mRNA的表達(dá)方面，吡格列酮組、中劑量組作用明顯（P<0.01），而在 GSK-3α mRNA的表達(dá)方面，中、高劑量降糖消渴顆粒則具有顯著優(yōu)勢(shì)（P<0.01）。

表3 降糖消渴顆粒及吡格列酮對(duì)各組小鼠肝臟IRS-2、Akt、GSK-3αmRNA 表達(dá)的影響（±s）Tab.3 Effect of JTXK Granule and pioglitazone on the liver IRS-2，Akt，GSK-3αmRNA expressions in mice of each group（±s）

注：正常組為C57BL/6J小鼠，其余為KK-Ay小鼠。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

分組 IRS-2RQ AktRQ GSK-3αRQ動(dòng)物數(shù) 劑量（g/kg）正常組 1.01±0.18** 1.01±0.13** 1.01±0.16**模型組 0.04±0.01 0.38±0.05 1.89±0.32吡格列酮組 0.21±0.06** 0.63±0.03** 1.56±0.27降糖消渴顆粒組 0.22±0.03** 0.46±0.12 1.19±0.15**0.27±0.11** 0.82±0.19** 1.37±0.28**0.16±0.06* 0.48±0.05 1.67±0.43 4 4 4 4 4 4- -0.006 5 7.00 3.50 1.75

4 討論

《素問(wèn)·經(jīng)脈別論》有云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行?！边@段原文描述了食物進(jìn)入胃內(nèi)，通過(guò)脾氣“散精”的功能將飲食物中的精微物質(zhì)布散至全身，與其他臟腑協(xié)同合作，發(fā)揮脾胃后天之本作用的過(guò)程。其間除脾臟功能的正常發(fā)揮起到?jīng)Q定性作用外，還需依賴肝主疏泄與腎主水液功能的正常。糖類(lèi)、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均屬于中醫(yī)“水谷精微”范疇，正常情況下負(fù)責(zé)為機(jī)體維持生命活動(dòng)提供能量[14]。在糖尿病狀態(tài)下，肝脾腎3臟功能的失調(diào)導(dǎo)致水谷精微物質(zhì)無(wú)法正常流轉(zhuǎn)，在體內(nèi)積聚成痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，堆積日久化熱反過(guò)來(lái)影響三臟功能，進(jìn)一步加劇糖尿病的糖脂代謝紊亂狀態(tài)[15]。

肝糖原是機(jī)體內(nèi)葡萄糖的有效儲(chǔ)存形式之一，糖異生及肝臟內(nèi)糖原合成是機(jī)體血糖的重要來(lái)源和消耗途徑，肝糖原的合成減少或分解增多都會(huì)引起血糖升高，與糖尿病的糖代謝紊亂密切相關(guān)[16]。IRS-2是胰島素信號(hào)通路的重要信號(hào)蛋白之一，在肝臟中大量表達(dá)，可促進(jìn)肝糖原的合成及抑制肝臟中葡萄糖的輸出，其功能異常不僅會(huì)減少肝糖原的合成，還會(huì)減弱肝臟對(duì)葡萄糖輸出的抑制作用，產(chǎn)生糖代謝的障礙[17-18]。蛋白激酶B（PKB）是胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，調(diào)控機(jī)體糖代謝的關(guān)鍵酶，可阻止肝臟的糖異生作用[19]，還可抑制糖原合成酶激酶-3α（GSK-3α）活性，從而使糖原合成酶活性增強(qiáng)，糖原合成量增加，起到降低血糖的作用[20]。GSK-3α是介導(dǎo)糖原合成的關(guān)鍵酶[21]，受胰島素調(diào)控，可磷酸化糖原合成酶使其失活，負(fù)反饋調(diào)節(jié)糖原合成，維持體內(nèi)葡萄糖的相對(duì)穩(wěn)態(tài)。肝組織內(nèi)GSK-3α mRNA表達(dá)的減少可降低對(duì)糖原合成酶的抑制作用，導(dǎo)致糖原合成酶活化，促進(jìn)肝細(xì)胞攝取利用血液中的葡萄糖，合成肝糖原儲(chǔ)存在肝臟中，從而起到降低血糖，緩解體內(nèi)糖代謝異常的作用[22-23]。降糖消渴顆粒發(fā)揮其降糖效應(yīng)的可能機(jī)制之一是通過(guò)提高肝臟的糖原合成能力，促進(jìn)血糖向肝糖原轉(zhuǎn)化的作用實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)中高、中劑量降糖消渴顆粒對(duì)糖尿病小鼠的食欲均有不同程度的抑制作用，中、低劑量降糖消渴顆粒還具有降低糖尿病小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率的趨勢(shì)，這說(shuō)明降糖消渴顆粒調(diào)節(jié)糖代謝的途徑之一可能是在一定程度上改善糖尿病的“多食”狀態(tài)，以減少血糖的來(lái)源。在肝臟胰島素信號(hào)通路方面，各劑量降糖消渴顆粒通過(guò)上調(diào)實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟胰島素信號(hào)通路中IRS-2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝臟對(duì)葡萄糖的攝取和利用，合成肝糖原并抑制肝臟葡萄糖的輸出；中劑量同時(shí)上調(diào)Akt的表達(dá)來(lái)減少肝臟糖異生，調(diào)節(jié)糖代謝。在肝臟糖原儲(chǔ)備方面，糖尿病小鼠肝臟發(fā)生了不同程度的脂肪化變性，破壞了細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，肝糖原合成及儲(chǔ)存能力遭到破壞。結(jié)合IOD/Area值可以看出，經(jīng)吡格列酮及高、低劑量降糖消渴顆粒治療后的糖尿病小鼠肝糖原變化不明顯，而中劑量體現(xiàn)出了增加肝糖原含量的優(yōu)勢(shì)。除此之外，高、中劑量降糖消渴顆粒明顯下調(diào)了肝組織中GSK-3α的mRNA表達(dá)，負(fù)反饋活化糖原合成酶，肝臟合成糖原能力增強(qiáng)。但本實(shí)驗(yàn)中正常組小鼠肝糖原含量低于各組糖尿病小鼠，這可能是由于基礎(chǔ)飼料和高脂飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的差異性引起的。

綜上所述，中劑量降糖消渴顆粒可以減少攝入體內(nèi)的葡萄糖；增加肝臟中IRS-2和調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝關(guān)鍵酶Akt的表達(dá)，以減少糖異生，與此同時(shí)下調(diào)GSK-3α的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化成肝糖原儲(chǔ)存在肝臟中。