李勇曉，孫 燕，張瑞生

(鄭州市婦幼保健院 麻醉科，河南 鄭州 450000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)為發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，易發(fā)人群為絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性[1]。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率明顯上升，對于早期子宮內(nèi)膜癌患者一般采取手術(shù)治療，對于無法手術(shù)或復(fù)發(fā)的子宮內(nèi)膜癌患者大多采取放射治療和化學(xué)治療，但對患者正常身體機能的副作用較大。因此，探索新的治療策略對于子宮內(nèi)膜癌的臨床治療具有重要意義。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是細胞增殖過程中的重要調(diào)節(jié)因子，它可由蛋白激酶B(protein kinase B, PKB，又稱Akt)啟動并活化，活化的mTOR調(diào)控下游效應(yīng)蛋白核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1, S6K1)的表達，影響細胞周期從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡等[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路的激活與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[4]。抑制mTOR信號通路的激活，可在抗腫瘤方面起到重要作用，這也成為了一種預(yù)防和治療腫瘤的新策略[5-6]。丙泊酚(propofol)是一種短效的靜脈麻醉藥物，因其具有起效快、副作用小等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于臨床中。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制癌細胞增殖并且誘導(dǎo)其凋亡，對腫瘤具有調(diào)控作用[7]。目前，關(guān)于丙泊酚對子宮內(nèi)膜癌的作用鮮有報道。本研究采用丙泊酚干預(yù)子宮內(nèi)膜癌細胞系細胞，以觀察癌細胞增殖及凋亡情況的變化，從分子水平上去探究丙泊酚對mTOR信號通路的影響，為子宮內(nèi)膜癌治療提供一定的理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人子宮內(nèi)膜癌細胞系RL95-2(武漢云克隆動物有限公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒：丙泊酚(propofol)(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)；二甲基亞砜(DMSO)、0.2%胰蛋白酶溶液和細胞裂解液(Invitrogen公司)；caspase-3和caspase-9活性測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)；抗-Akt、-p-Akt、-mTOR、 -p-mTOR、 -S6K1和-p-S6K1抗體[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 實驗的分組及處理：將RL95-2細胞隨機分為：對照組：10 %胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、丙泊酚低(1.25 mmol/L)、中(2.5 mmol/L)和高劑量組(5 mmol/L)。每組10例，均在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測RL95-2細胞增殖：將RL95-2細胞以濃度為2×104個/mL接種于96孔板中，加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，利用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞增殖率%=丙泊酚處理組(A)/對照組(A)×100%。

1.2.3 克隆形成實驗檢測RL95-2細胞克隆形成：將RL95-2配制成濃度為1×106個/mL的單細胞懸液，2 mL/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去上層培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶對細胞進行消化，加入新的培養(yǎng)基終止消化后，4 ℃、1 500 r/min離心10 min收集細胞。將各組細胞重懸并以1 000個/10 cm皿的密度接種于含DMEM培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2～3周，期間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，終止培養(yǎng)并對細胞進行固定和染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 流式細胞測量術(shù)檢測RL95-2細胞凋亡：將RL95-2以濃度為1×106個/mL接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，用胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞。無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細胞2次，隨后用annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液將細胞重懸，再次調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。取各組100 μL重懸后的細胞分別加入流式管中，做好分組標(biāo)記，再向流式管中加入5 μL抗 annexin V-FITC抗體和抗5 μL annexin V-PI抗體，快速混合均勻后避光孵育15 min，加入400 μL緩沖液混勻后上樣流式細胞儀，分析細胞凋亡情況，注意全程冰上操作。

1.2.5 比色法檢測RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性：將RL95-2細胞以1×106個/mL的接種于細胞培養(yǎng)瓶中，加入胰蛋白酶對細胞進行消化，1 500 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌1次，收集細胞并加入細胞裂解液作用15 min，4 ℃低溫10 000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進行caspase-3和caspase-9活性測定，通過酶標(biāo)儀測定405 nm吸光度(A)值。

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測細胞Akt、mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平：將RL95-2細胞以濃度為1×106個/mL接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細胞，終止后低溫1 500 r/min離心10 min，無菌PBS洗滌細胞2次，再次離心棄上清，加入細胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白。蛋白定量后進行SDS-PAGE，小心取出凝膠并用蛋白轉(zhuǎn)膜儀進行PVDF轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1 000)的對應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2 000)的二抗溶液，室溫搖床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對RL95-2細胞增殖的影響

當(dāng)丙泊酚濃度為10 mmol/L時，RL95-2細胞增值率下降至77.36%±4.55%，說明丙泊酚濃度大于等于10 mmol/L會對RL95-2細胞有明顯的細胞毒性(表1)。因此，在后續(xù)試驗中將丙泊酚的濃度設(shè)定為：低(1.25 mmol/L)、中(2.5 mmol/L)和高劑量組(5 mmol/L)。

相比于對照組，丙泊酚各組RL95-2細胞增殖率和細胞克隆形成能力顯著降低(P<0.05)(圖1，表2)。

表1 不同濃度丙泊酚對RL95-2細胞增值率的影響

表2 丙泊酚對RL95-2細胞增殖率和細胞克隆形成能力的影響

2.2 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響

丙泊酚各組相比于對照組，RL95-2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖2，表3)。

2.3 丙泊酚對RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性的影響

相比于對照組，丙泊酚各組RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性明顯升高(P<0.05)(表4)。

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖1 丙泊酚對RL95-2細胞克隆形成能力的影響Fig 1 Effect of propofol on the clone formation ability of RL95-2 cells

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖2 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of propofol on apoptosis of RL95-2 cells

表3 丙泊酚對RL95-2細胞凋亡的影響

表4 丙泊酚對RL95-2細胞caspase-3和caspase-9活性的影響

2.4 丙泊酚對RL95-2細胞Akt、mTOR、S6K1和STAT3蛋白磷酸化水平的影響

丙泊酚各組RL95-2細胞中Akt、mTOR和S6K1蛋白磷酸化水平均顯著低于對照組(P<0.05)(圖3，表5)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤， 發(fā)病率僅次于宮頸癌和卵巢癌， 多見于55歲左

A.control group; B.propofol low dose group; C.propofol medium dose group; D.propofol high dose group圖3 丙泊酚對RL95-2細胞p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-S6K1和S6K1蛋白表達水平的影響Fig 3 Effects of propofol on the protein expressions of p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, p-S6K1 and S6K1 in RL95-2 cells

表5 丙泊酚對RL95-2細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-S6K1/S6K1水平的影響

右的絕經(jīng)婦女?；颊甙Y狀表現(xiàn)為出血、陰道排液、疼痛以及腹部包塊等?；颊叱掷m(xù)出血或會導(dǎo)致繼發(fā)性貧血；腫瘤擴散可于腹股溝等多處發(fā)現(xiàn)腫大的或融合的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶；長期病痛和消耗使患者出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱、消瘦及惡病質(zhì)等全身衰竭的表現(xiàn)[8]。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅女性身心健康。尋求安全高效的子宮內(nèi)膜癌治療策略成為專家學(xué)者們亟待解決的問題。

丙泊酚為靜脈麻醉藥物，于80年代中期開始應(yīng)用于臨床。鑒于其顯著的優(yōu)勢：起效迅速、可控性強、維持時間短、蘇醒較快、副作用小并且無積蓄等，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)麻醉及鎮(zhèn)靜。近年來，發(fā)現(xiàn)丙泊酚參與許多與癌相關(guān)的病理生理過程，它可通過調(diào)節(jié)多種信號通路、下游分子和微小RNA等的表達，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；還可以增強化療藥物或一些小分子化合物的抗腫瘤作用[9-10]。研究報道，丙泊酚可抑制低氧誘導(dǎo)的食管癌細胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。有報道[12]用丙泊酚對肺、結(jié)腸、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎和卵巢癌細胞進行干預(yù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可下調(diào)細胞中的6個促癌基因、上調(diào)8個抗癌基因，并且干擾癌細胞的代謝，引起糖代謝紊亂，降低腫瘤的惡性程度。本研究結(jié)果表明，丙泊酚可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和克隆形成能力，上調(diào)凋亡相關(guān)的caspase-3和caspase-9活性，促進細胞凋亡。提示，丙泊酚在子宮內(nèi)膜癌中可起到抗腫瘤作用，在子宮內(nèi)膜癌治療手術(shù)中用丙泊酚作為麻醉劑或可能改善患者預(yù)后。

研究報道，mTOR信號通路在多種人類腫瘤中存在高表達和高活化，如宮頸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等，抑制mTOR在腫瘤治療中具有重要作用[13-14]。近年，隨著對mTOR信號通路的逐步研究，該通路在腫瘤相關(guān)發(fā)展進程(例如細胞增殖、新陳代謝和細胞凋亡等)中的機制日益清晰，靶向抑制mTOR信號通路的激活成為癌治療的一個較有潛力的研究方向。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚干預(yù)后的子宮內(nèi)膜癌細胞中Akt、mTOR和S6K1磷酸化水平均顯著降低。結(jié)合已有的研究報道[15]，抑制mTOR通路可下調(diào)其下游介質(zhì)(如S6K1)的激活，引起細胞周期阻滯從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡，推測本研究中，丙泊酚可能通過抑制mTOR信號通路的激活，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

綜上所述，丙泊酚可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，可能調(diào)控mTOR信號通路，降低S6K1蛋白活化水平，促進癌細胞凋亡。但丙泊酚對子宮內(nèi)膜癌的臨床效用還需更多臨床驗證。