王 布，袁勝芳，張長(zhǎng)洪，苑 程，黃攀登，張志華，趙建清

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 河北 張家口 075000)

肺癌是癌相關(guān)死亡的第一大因素，主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類型；其中，肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小細(xì)胞肺癌最常見(jiàn)的亞型，有著較低的總體生存率[1]。目前，靶向治療是肺癌治療的一種重要手段，有著高效和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)；然而，肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅僅依賴于一種基因或通路的調(diào)控，單一的靶點(diǎn)模式不足以遏制腫瘤生長(zhǎng)，因此多靶點(diǎn)聯(lián)合治療已成為肺癌研究的熱點(diǎn)。真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF2K)是α-激酶小家族中唯一的Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶，可通過(guò)磷酸化其底物eEF-2抑制肽鏈延伸過(guò)程，并可通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。已有研究指出，eEF2K在肺癌中高表達(dá)，而靶向抑制其表達(dá)可阻斷肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549轉(zhuǎn)移[3]，但其是否參與肺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控并不清楚。丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)是中藥丹參有效成分丹參酮ⅡA的一種水溶性成分。丹參酮ⅡA可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制A549細(xì)胞增殖的作用[4]，同時(shí)STS被證實(shí)可通過(guò)聯(lián)合順鉑起到協(xié)同抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用[5]。然而，靶向抑制eEF2K與STS聯(lián)合作用于肺癌能否起到協(xié)同抗腫瘤的作用并不清楚。因此，本研究以A549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)觀察靶向抑制eEF2K與STS二者聯(lián)合對(duì)A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響并探討其可能的作用機(jī)制，以期為肺癌的臨床多靶點(diǎn)治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)；丹參酮ⅡA 磺酸鈉(STS)(上海第一生化藥業(yè)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、脂質(zhì)體3000、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測(cè)試劑盒和Transwell小室(北京索萊寶科技有限公司)，靶向eEF2K基因的siRNA(siRNA-eEF2K)及其陰性對(duì)照(siRNA-NC)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(百奧邁克生物公司)；胎牛血清、Trizol試劑、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)(上海生工生物工程有限公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallo-proteinase 2，MMP-2)、eEF2K、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、磷酸化(phospho，p)-AKT和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理：篩選STS作用濃度：1)分為5個(gè)STS處理組(1.25、2.5、5、10和20 μg/mL STS)和無(wú)藥組(0 μg/mL STS)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)復(fù)孔，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)STS作用濃度。在80%相對(duì)濕度、5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)使用含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞。2)將指數(shù)期的A549細(xì)胞接種至6孔板上后，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體3000說(shuō)明書步驟將siRNA-eEF2K及siRNA-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別作為siRNA-NC組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC 48 h后繼續(xù)培養(yǎng)48 h)、siRNA-eEF2K組(轉(zhuǎn)染siRNA-eEF2K 48 h后繼續(xù)培養(yǎng)48 h)、siRNA-NC+STS組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC 48 h后給予10 μg/mL STS作用48 h)、siRNA-eEF2K+STS組(轉(zhuǎn)染siRNA-eEF2K 48 h后給予10 μg/mL STS作用48 h)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A549細(xì)胞eEF2K mRNA表達(dá)：向A549細(xì)胞中加入1 mL Trizol試劑提取總RNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；將cDNA作為模板，根據(jù)合成的eEF2K引物(上游引物：5′-GAAC ATGAGCGACGTGACCTTC-3′；下游引物：5′-GGATG CCATGTTATCGAGGTCAC-3′)及內(nèi)參GAPDH引物(上游引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′；下游引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′)在20 μL反應(yīng)體系(cDNA 2 μL、濃度20 μmol/L的正反引物各0.2 μL、SYBR Premix Ex Tag 10 μL和H2O 7.6 μL)下于熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。其中，擴(kuò)增條件為95 ℃ 4 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)階段：95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s。將GADPH作為內(nèi)參基因，以2-△△Ct法計(jì)算A549細(xì)胞中eEF2KmRNA表達(dá)水平。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞存活率：向處理后的細(xì)胞中加入10 μL CCK-8試劑；孵育30 min后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A549細(xì)胞吸光度值(A)值，并根據(jù)公式存活率(%)=(藥物組A-空白組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%計(jì)算各處理組細(xì)胞的存活率。空白組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞克隆形成率：胰蛋白酶消化收集指數(shù)期的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后將其按照每孔500個(gè)種植到6孔板上。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)10～14 d，待有肉眼可見(jiàn)克隆形成時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)；棄培養(yǎng)液后，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，滴加Giemsa染色液染色10 min；洗去染色液后，肉眼觀察各組克隆細(xì)胞數(shù)，并以克隆細(xì)胞數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的百分比表示各組細(xì)胞的克隆形成率。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)A549細(xì)胞穿膜數(shù)：按照1∶3比例以無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)Matrigel膠稀釋后，取40 μL平鋪至Transwell小室底部膜的上層，并在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。收集處理結(jié)束后的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為1×106個(gè)/mL。在Transwell小室上室內(nèi)每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，小室下室內(nèi)每孔加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μL；置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜后，取出Transwell小室；棉簽擦去上室殘留細(xì)胞后，分別以4%多聚甲醛和0.5%結(jié)晶紫染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定15 min、染色10 min。洗去染色液后，采用倒置顯微鏡于200倍下觀察統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移率：在6孔板背面以Marker筆過(guò)孔畫橫線，其中每孔有5條橫線穿過(guò)。將指數(shù)期的A549細(xì)胞接種至6孔板上后，根據(jù)1.2.1中實(shí)驗(yàn)2)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組處理；待處理結(jié)束后，以移液槍槍頭垂直于橫線劃痕。以磷酸緩沖液洗去劃下的細(xì)胞后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0 h和24 h時(shí)間點(diǎn)拍照并計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。其中，遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率：胰蛋白酶消化收集處理結(jié)束后的siRNA-NC組、siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞后，以預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞2次。1 000 r/min離心5 min，加入1×結(jié)合緩沖液200 μL懸浮細(xì)胞后，先后加入annexin V-FITC和PI工作液各5 μL，混勻后避光下室溫孵育15 min后，補(bǔ)加1×結(jié)合緩沖液300 μL后，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.2.8 免疫印跡法檢測(cè)A549細(xì)胞eEF2K、AKT、p-AKT、ki67、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)水平：胰蛋白酶消化收集待測(cè)的A549細(xì)胞后，加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白。對(duì)蛋白樣品定量后，與等體積上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中煮沸變性5 min。行SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白樣品轉(zhuǎn)至偏氟乙烯膜上。置于含脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h后，在4 ℃下以特異性一抗eEF2K(1∶1 000)、AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、Ki67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)孵育過(guò)夜；次日，再以二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h后，加ECL發(fā)光劑于暗室內(nèi)顯影曝光。以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像分析系統(tǒng)分析eEF2K、AKT、p-AKT、ki67、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)水平。該過(guò)程重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 STS對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞作用濃度的篩選

相較于無(wú)藥組，1.25、2.5、5、10、20 μg/mL STS處理組作用48 h后A549細(xì)胞存活率均明顯降低(P<0.05)(表1)且呈一定的濃度依賴性。采用GraphPad Prism軟件計(jì)算出STS對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為10.39 μg/mL。故后期選取10 μg/mL STS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度STS作用48 h后A549細(xì)胞的存活率

2.2 轉(zhuǎn)染后肺腺癌A549細(xì)胞中eEF2K表達(dá)

與siRNA-NC組比較， siRNA-eEF2K組細(xì)胞中eEF2K蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)(圖1，2)。

圖1 A549細(xì)胞中eEF2K蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of eEF2K protein in A549 cells

*P<0.05 compared with siRNA-NC group圖2 A549細(xì)胞中eEF2K蛋白和mRNA的表達(dá)Fig 2 Expression of eEF2K protein and mRNA

2.2 STS聯(lián)合eEF2K-siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞存活率、克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞存活率和克隆形成率明顯低于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖3，4)。

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig 3 Results of clonal formation test

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 compared with siRNA-NC+STS group圖4 各組A549細(xì)胞存活率和克隆形成率Fig 4 A549 cell survival rate and clone formation rate in each

2.3 STS聯(lián)合eEF2K-siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲的影響

與siRNA-NC組比較，siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組中穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組中穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖5，6)。

2.4 STS聯(lián)合eEF2K-siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞遷移率較siRNA-NC組均明顯降低(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞遷移率明顯低于siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖7)。

圖5 Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Transwell migration assay test results(×200)

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 compared with siRNA-NC+STS group圖6 各組中穿膜A549細(xì)胞數(shù)、遷移率Fig 6 Number of transmembrane A549 cells and cell migration rate in each

2.5 STS聯(lián)合eEF2K-siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞凋亡率較siRNA-NC組均明顯升高(P<0.05)，且siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞凋亡率明顯高于siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖8，9)。

2.6 STS聯(lián)合eEF2K-siRNA對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞中AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

siRNA-eEF2K組、siRNA-NC+STS組和siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞中p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于siRNA-NC組(P<0.05)，而siRNA-eEF2K+STS組細(xì)胞中上述各指標(biāo)明顯低于siRNA-eEF2K組和siRNA-NC+STS組(P<0.05)(圖10，11)。

圖7 A549細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig 7 Test results of scratch assay for A549 cells(×40)

圖8 各組A549細(xì)胞凋亡率Fig 8 Apoptosis rate of A549 cells in each group

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 comp-ared with siRNA-NC+STS group圖9 各組A549細(xì)胞凋亡率Fig 9 Apoptosis rate of A549 cells in each group

3 討論

越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，eEF2K有助于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是癌潛在的治療靶點(diǎn)。eEF2K在食管鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和減少細(xì)胞凋亡促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展[6]；eEF2K抑制劑可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮抗乳腺癌的作用[7]。本研究轉(zhuǎn)染siRNA-eEF2K成功下調(diào)eEF2K表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，肺腺癌A549細(xì)胞存活率、克隆形成率、穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移率均明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，該結(jié)果與報(bào)道[3]吻合。提示eEF2K促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展，靶向干擾其表達(dá)可能是肺癌治療的重要策略。

丹參酮ⅡA是活血化瘀藥丹參的有效成分，具有良好的抗肺癌作用[8]， 還可提高化學(xué)藥物治療(化療)治療肺癌的臨床療效[9]。作為丹參酮ⅡA水溶性成分代表，STS與順鉑聯(lián)用可協(xié)同上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制小鼠肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。然而，靶向抑制eEF2K表達(dá)和STS聯(lián)合作用是否可協(xié)同抗肺癌并不清楚。本研究結(jié)果表明，靶向抑制eEF2K聯(lián)合STS可協(xié)同抑制A549細(xì)胞增生。提示eEF2K沉默聯(lián)合STS具有協(xié)同抗肺癌的作用。

圖10 A549細(xì)胞中AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達(dá)Fig 10 Expression of AKT, p-AKT, Ki67, MMP-2 and Bcl-2 proteins in A549 cells

AKT處于PI3K/AKT通路的核心地位，其磷酸化激活后參與細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程；Ki67是細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要抗原，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞增殖情況；MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族，參與細(xì)胞侵襲和遷移過(guò)程；Bcl-2參與調(diào)控線粒體凋亡途徑，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用；AKT活化可調(diào)控Ki67、MMP-2和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展[10-12]。研究顯示，靶向干擾eEF2K表達(dá)可降低AKT活性[13-14]；同時(shí)，丹參酮ⅡA也可通過(guò)抑制AKT活性增強(qiáng)吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用[15]。為了探討eEF2K基因沉默聯(lián)合STS協(xié)同抗肺癌的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，eEF2K沉默聯(lián)合STS可協(xié)同抑制A549細(xì)胞中p-AKT及Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達(dá)。提示eEF2K沉默聯(lián)合STS發(fā)揮抗肺癌的作用可能是通過(guò)共同抑制p-AKT及Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

*P<0.05 compared with siRNA-NC group; #P<0.05 compared with siRNA-eEF2K group; △P<0.05 comp-ared with siRNA-NC+STS group圖11 各組A549小樂(lè)趣AKT、p-AKT、Ki67、MMP-2和Bcl-2蛋白表達(dá)水平Fig 11 Expression of AKT, p-AKT, Ki67, MMP-2 andBcl-2 proteins in each group of A549 cells

綜上所述，eEF2K沉默聯(lián)合STS可協(xié)同抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其作用機(jī)制可能與共同抑制p-AKT、Ki67、MMP-2、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究只在肺腺癌A549細(xì)胞中初步探討了eEF2K沉默聯(lián)合STS抗肺癌的作用，后續(xù)還將在肺癌其他細(xì)胞株及移植瘤小鼠中進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為肺癌化療耐藥及多靶點(diǎn)治療提供新線索。