王靈霞，嚴(yán)玉蘭，袁海濤，蔡燁偉，劉德慧，谷文露，曹碧月

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科；3.普外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，上海 201600)

在全球范圍內(nèi)，肺癌(lung canccer)是危害人類健康常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位居首位[1]。近年來，肺腺癌在肺癌中的發(fā)病率逐年增加，盡管分子靶向治療取得了較好的臨床效果，但因突變?nèi)巳宏栃月势?，肺腺癌患者總體5年生存率仍徘徊在20%左右[2]。因此，尋找新的肺腺癌早期診斷生物標(biāo)志物和治療靶點是迫切需要的。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類不具有或僅部分有編碼功能的共價閉合新型RNA分子，可在哺乳動物體內(nèi)穩(wěn)定存在。既往研究證實，circRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)并誘導(dǎo)癌的發(fā)生發(fā)展[3]。CircRNA_001569在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]。本研究通過高通量測序技術(shù)篩選出顯著差異性表達(dá)的環(huán)狀RNA circRNA_23113，然后檢測其在肺腺癌組織、血清及肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并構(gòu)建circRNA_23113過表達(dá)載體，對肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移生物學(xué)功能進(jìn)行體外水平研究和初步機(jī)制探索，以期明確肺腺癌新型分子靶標(biāo)，為臨床診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：選取2019年1月至2020年1月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院接受手術(shù)切除的肺腺癌患者癌組織及癌旁組織標(biāo)本60對，所有患者均未接受術(shù)前化療或放療，術(shù)中及術(shù)后病理均提示肺腺癌；另采集45例肺腺癌患者未治療前及 45例門診體檢健康者的外周血5 mL于抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心后收集血清于1.5 mL無酶管，-80 ℃儲存?zhèn)溆?。該研究?jīng)過江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：K-20180043-Y)，并獲得參與者簽署的知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及試劑：人肺腺癌細(xì)胞系(A549、H1299、H1975細(xì)胞)和人支氣管黏膜上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；Trizol及Trizol LS試劑(Ambion公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；過表達(dá)質(zhì)粒(上海吉凱基因科技有限公司)；Lipofectamine 2000 Reagents(Invitrogen公司)；CCK-8試劑盒、Transwell小室(Corning公司)；兔β-catenin(Abcam公司)；cyclin D1、c-myc、β-actin(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組處理：所有細(xì)胞用含有10%胎牛血清、含青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過表達(dá)質(zhì)粒組(OE-circRNA_23113組)和陰性對照組(OE-NC組)使用Lipofectamine 2000 Reagents將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到H1299和A549細(xì)胞中，每次轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA：按照說明書的實驗步驟，使用Trizol及Trizol LS試劑來提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒加樣后，在Applied Biosystems 7500 實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行PCR 測定。所有實驗重復(fù)3次，并采用2-ΔΔCt方法分析circRNA_23113相對表達(dá)水平。選擇GADPH作為內(nèi)參。GADPH引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATG AT-3′(正向)和5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′(反向)。CircRNA_23113引物序列5′-TCATCTTCACC CAGGTGTC-3′(正向)和5′-TCCTGTGCCATCTCCA ATTC-3′(反向)。

1.2.3 CCK-8法測定細(xì)胞活力：通過CCK-8試劑盒評估不同組細(xì)胞活力。將相應(yīng)處理后的H1299和A549細(xì)胞(5×103個細(xì)胞/孔)接種到96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng) 0、24、48和72 h，然后，將10 μL CCK-8和100 μL完全培養(yǎng)基加入每個孔中，將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2下再培養(yǎng)1～2 h。最后，使用分光光度計測量450 nm處的吸光度值以代表細(xì)胞活力。每組實驗設(shè)置5個復(fù)孔。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細(xì)胞集落形成：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(1×103個細(xì)胞/孔)接種在6孔板中。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d后，4%多聚甲醛固定30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，用0.1%結(jié)晶紫染色菌落30 min，蒸餾水清洗干凈晾干后使用Image J軟件進(jìn)行克隆細(xì)胞團(tuán)計數(shù)。克隆形成率(%) = (克隆團(tuán)數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移：用細(xì)胞劃痕實驗評估肺腺癌細(xì)胞的遷移能力變化。待6孔板細(xì)胞鋪滿90%以上時，10 μL 移液槍頭與直尺垂直在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)劃痕，每孔穿過5條線，劃痕后用PBS漂洗細(xì)胞3次，清除劃掉的貼壁細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，同時用OE-NC質(zhì)粒或circRNA_23113過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，觀察拍照后計為0 h，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再次取樣觀察、倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移：通過Transwell小室遷移實驗檢測肺腺癌細(xì)胞的遷移能力。將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞消化后，用200 μL 無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(5×104個細(xì)胞/孔)接種在Transwell(不含基質(zhì)膠)上層小室內(nèi)，在下層小室中添加800 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基。然后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育24 h 后取出，棄去小室中的培養(yǎng)液，醫(yī)用棉簽輕柔擦拭小室上層內(nèi)側(cè)未遷移的細(xì)胞，用PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗干凈后倒扣在超凈臺內(nèi)風(fēng)吹晾干，最后在倒置熒光顯微鏡下拍照并使用Image J軟件計數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)：使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)。通過10%的SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白質(zhì),350 mA 110 min轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。3% BSA封閉2 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜。兔β-catenin(1∶500)，cyclin D1、c-myc(1∶1 000)。然后，將膜與山羊抗兔二抗(1∶5 000)在37 ℃下孵育2 h。β-actin(1∶1 000)作為內(nèi)參對照。使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CircRNA_23113的篩選

篩選出在肺腺癌與癌旁組織中具有顯著差異性表達(dá)的環(huán)狀RNA circRNA_23113(圖1)。

圖1 高通量測序結(jié)果Fig 1 High-throughput sequencing results

2.2 CircRNA_23113在肺腺癌組織、血漿和細(xì)胞系中顯著下調(diào)

CircRNA_23113在60例肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.001)；肺腺癌患者血漿中circRNA_23113表達(dá)水平低于健康體檢者(P<0.001)，circRNA_23113在肺腺癌細(xì)胞系H1975、H1299、A549的表達(dá)水平均低于正常支氣管黏膜上皮細(xì)胞BEAS-2B(P<0.05)。體外實驗選擇表達(dá)水平最低的A549和較低的H1299肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行circRNA_23113過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用于后續(xù)實驗(圖2)。

2.3 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞后circRNA_23113表達(dá)水平明顯升高

CircRNA_23113過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H1299、A549肺腺癌細(xì)胞24h后,OE-circRNA_23113組circRNA_23113的表達(dá)水平較OE-NC組明顯升高(P<0.05)，表示轉(zhuǎn)染有效(圖3)。

A.expression of circRNA_23113 in lung adenocarcinoma tissue n=3)；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with normal control group

*P<0.05 compared with negative control group圖3 H1299和A549細(xì)胞中上調(diào)circRNA_23113表達(dá)的轉(zhuǎn)染效率Fig 3 Up-regulated transfection efficiency of circRNA_23113 expression in H1299 and A549 cells n=3)

2.4 CircRNA_23113表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞增殖

CircRNA_23113過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系H1299、A549后，其細(xì)胞活力較OE-NC組顯著受到抑制(圖4A)。CircRNA_23113過表達(dá)后抑制了H1299、A549的克隆形成(P<0.05或P<0.01)(圖4B)。

2.5 CircRNA_23113抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移

肺腺癌細(xì)胞系H1299、A549中OE-circRNA_23113組的劃痕愈合率明顯低于OE-NC組(P<0.01或0.05) (圖5A)。肺腺癌細(xì)胞H1299、A549中OE-circRNA_23113組的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯低于OE-NC組(P<0.05)(圖5B)。

2.6 過表達(dá)circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表達(dá)

過表達(dá)circRNA_23113后，OE-circRNA_23113組較OE-NC組顯著降低了A549和H1299細(xì)胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc的蛋白表達(dá) (P<0.01或0.001)(圖6)。

A.after circRNA_23113 over-expression the cell viability of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; B.after circRNA_23113 over-expression the colone formation of H1299 and A549 cells was significantly inhibited; *P<0.05,**P<0.01 compared with negative control group

3 討論

肺癌是中國癌相關(guān)死亡的主要原因。盡管治療方式取得了進(jìn)步，肺癌患者的預(yù)后仍然很差[5]。肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多基因、多因素、多通路，特別是與增殖和遷移相關(guān)分子的異常激活。相比線性RNA,circRNA缺乏5′末端帽子和3′末端多聚A尾結(jié)構(gòu)，不易被核糖核酸酶降解，此特殊結(jié)構(gòu)使其比線性RNA更易穩(wěn)定存在[6]。CircRNA與腫瘤的增殖、侵襲和凋亡密切相關(guān)，具有為個體化治療確定敏感的生物標(biāo)志物以改善臨床結(jié)局的潛力[3]。如circ_0007385在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且該基因敲除后可降低異種移植腫瘤的生長[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，在用肉桂醛處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，細(xì)胞中hsa_circ_0043256表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮顯著的抑癌作用抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明circRNA_23113在肺腺癌組織、血清及細(xì)胞中低表達(dá)。通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒，上調(diào)H1299、A549細(xì)胞中circRNA_23113表達(dá)水平后，利用CCK8法、克隆形成、細(xì)胞劃痕和Transwell小室遷移實驗觀察到circRNA_23113可作為抑癌基因顯著抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移。腫瘤的發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白分子的異常表達(dá)，參與癌細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。研究證實circ_001569通過激活Wnt1、TCF4和β-catenin的蛋白表達(dá)水平促進(jìn)了A549和H1299細(xì)胞的增殖[10]。上調(diào)circ-ITCH抑制了cyclin D1和c-myc的蛋白表達(dá)，減弱了乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。本研究須在H1299、A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染circRNA_23113過表達(dá)質(zhì)粒后，通過蛋白質(zhì)印跡法證實circRNA_23113過表達(dá)后抑制β-catenin、cyclin D1以及 c-myc蛋白表達(dá)。這與肺癌發(fā)生發(fā)展中β-catenin、cyclin D1以及c-myc低表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的增殖和遷移受到抑制相一致[12]。

A.after circRNA_23113 over-expression, the scratch healing rate of H1299 and A549 cells was significantly reduced; B.after circRNA_23113 over-expression, the migration number of H1299 and A549 cells was significantly reduced；*P<0.05, **P<0.01 compared with negative control group

綜上所述，本研究證實circRNA_23113在肺腺癌組織、血清及細(xì)胞中低表達(dá)和腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，并且circRNA_23113抑制β-catenin、cyclin D1以及c-myc的表達(dá)可能參與細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控。因此circRNA_23113有望成為肺腺癌預(yù)后判斷的一個新型生物標(biāo)志物，進(jìn)一步探究circRNA_23113調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制為肺腺癌的早期診斷和治療方案的確定具有顯著的指導(dǎo)意義。

*P<0.01,**P<0.001 compared with negative control group圖6 過表達(dá)circRNA_23113后，β-catenin、cyclin D1和c-myc的表達(dá)水平Fig 6 Expression levels of β-catenin, cyclin D1 and c-myc after over-expression of circRNA_23113 n=3)