滕培英，李 靜，師玉露，楊 帆，歐 霞，陳 偉

(昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500)

柯薩奇病毒B組5型(Coxsackie virus group B type 5，CVB5)屬小RNA病毒科腸道病毒屬，無(wú)包膜，基因組為單股正鏈RNA[1]。CVB5是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，主要感染5歲以下嬰幼兒，臨床癥狀通常表現(xiàn)為發(fā)熱，黏膜皮疹和皰疹等，病情嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致無(wú)菌性腦膜炎和急性弛緩性麻痹等神經(jīng)性并發(fā)癥，乃至死亡。近年來(lái)，由CVB5感染導(dǎo)致的HFMD呈爆發(fā)流行趨勢(shì)，對(duì)幼兒健康造成了嚴(yán)重威脅[2-4]。然而，目前尚無(wú)針對(duì)CVB5感染引起HFMD的有效治療手段和預(yù)防措施。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不具備蛋白編碼功能的非編碼RNA總稱，具有導(dǎo)向、海綿、分子誘餌以及與蛋白質(zhì)相互作用等多種生物學(xué)功能[5]。同時(shí)，越來(lái)越多的研究證明，lncRNA與病毒-宿主之間存在密切關(guān)系[6-7]。病毒感染宿主細(xì)胞后，可引起宿主編碼lncRNA的差異表達(dá)，它們通過(guò)調(diào)控免疫信號(hào)通路、病毒基因組轉(zhuǎn)錄翻譯和宿主細(xì)胞代謝產(chǎn)物等方式發(fā)揮了重要作用[8-9]。

LncRNA在腫瘤的研究中已有大量的報(bào)道應(yīng)用，然而關(guān)于lncRNA與病毒-宿主相互作用機(jī)制研究尚處于起步階段。因此，本研究通過(guò)分析CVB5感染人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞系RD(human malignant embryonic rhabdomyosarcoma cell line，RD)，細(xì)胞中差異lncRNA表達(dá)譜，從而為深入研究lncRNA調(diào)控CVB5與宿主之間的相互作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：DMEM(Hyclone公司)，RNAiso Plus、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司)。

1.1.2 細(xì)胞及病毒：人惡性胚胎橫紋肌瘤肉瘤細(xì)胞系RD(中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù))及CVB5病毒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。RD細(xì)胞接種于含有10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備：1×106個(gè)RD細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，1×PBS緩沖液洗2次，換為含2% FBS的DMEM維持液，使用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1的CVB5感染RD細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察RD細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effects，CPEs)。

1.2.2 CVB5 TCID50的測(cè)定：取增殖狀況良好的RD細(xì)胞，1×PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。按每孔3×104個(gè)細(xì)胞加入96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，用DMEM維持液將病毒液按10倍的梯度進(jìn)行稀釋，稀釋至10-1～10-12，按每孔50 μL病毒液加入過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。蓋上蓋子做好標(biāo)記，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天觀察并記錄CPE。第7天，統(tǒng)計(jì)病變情況并根據(jù)Reed Mench法計(jì)算病毒滴度。

1.2.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-seq)：1MOI CVB5接種RD細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，使用Trizol法提取總RNA。采用分光光度計(jì)Nanodrop檢測(cè)總RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳及Agilent 2100檢測(cè)RNA完整性。采用RNA-Seq PE150策略進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)圖譜分析(由北京諾和致源公司完成)。

測(cè)序完成后，獲得CVB5感染RD細(xì)胞lncRNA表達(dá)圖譜。隨后，采用去除核糖體RNA的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，Qubit2.0進(jìn)行初步定量，Aglient2100對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。以相對(duì)表達(dá)量變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>2，P<0.05作為差異顯著基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到的差異mRNA和lncRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

同時(shí)，使用Cuffdiff和ClusterProfiler軟件對(duì)差異lncRNA進(jìn)行聚類分析、GO分析和KEGG富集等生物信息學(xué)分析。

1.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證差異lncRNA的表達(dá)：對(duì)篩選得到的差異性顯著lncRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)驗(yàn)證，反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃，5 min反轉(zhuǎn)錄為cDNA；95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct方法分析RNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物名稱及其序列(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)：采用RNAfold軟件對(duì)篩選的lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而更好的預(yù)測(cè)lncRNA保守性及潛在結(jié)合區(qū)域。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CVB5感染RD細(xì)胞模型建立

1MOI CVB5感染RD細(xì)胞0、6、12、24、48和60 h時(shí)，通過(guò)測(cè)定病毒TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，median tissue culture infective dose)可知，CVB5感染24 h時(shí)，TCID50值最高(圖1A)。同時(shí)，CPE結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，CVB5感染24 h后，細(xì)胞產(chǎn)生顯著CPE(圖1B)。

2.2 差異mRNA和lncRNA表達(dá)分析

與對(duì)照組相比，CVB5感染RD后，共獲得4 860個(gè)差異表達(dá)的mRNAs(1 754個(gè)mRNAs上調(diào)表達(dá)和3 106個(gè)mRNAs下調(diào)表達(dá))和1 268個(gè)lncRNAs(508個(gè)lncRNAs上調(diào)表達(dá)和760個(gè)lncRNA下調(diào)表達(dá))(轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)No.GSE180816)。表2顯示了CVB5感染后RD細(xì)胞中20個(gè)上調(diào)和下調(diào)最顯著的lncRNA。對(duì)所有差異mRNA和lncRNA聚類分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CVB5感染RD細(xì)胞后，宿主細(xì)胞中mRNA和lncRNA表達(dá)圖譜均發(fā)生了顯著變化(圖2)。

A.RD cells were inoculated with the CVB5, and supernatant cultuers were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post-infection and virus titers were determined using TCID50; B.typical CPEs caused by RD infected with CVB5 were observed and photographed using inverted microscope at 24 hours post-infection

表2 CVB5感染的RD細(xì)胞中20個(gè)上調(diào)和20個(gè)下調(diào)最顯著的lncRNATable 2 20 most significantly each up-regulated and down-regulated lncRNAs in CVB5 infected RD cells

Compared with the control group, clustering profiles of mRNA (A) and lncRNA (B) expression in RD cells infected with CVB5; red represented genes with increased expression, and blue represented genes with decreased expression

2.3 LncRNA與mRNA特征比較

與mRNA相比，lncRNA轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度主要集中在5 kb以內(nèi)，外顯子個(gè)數(shù)小于10個(gè)，ORF長(zhǎng)度小于300個(gè)核苷酸(圖3)。

2.4 GO分析和KEGG通路富集預(yù)測(cè)lncRNA生物功能

與下游靶基因共表達(dá)的lncRNA主要富集在結(jié)構(gòu)分子活性、細(xì)胞因子活性和嗅覺(jué)感受過(guò)程等20個(gè)顯著富集的GO條目中(圖4A)；差異表達(dá)lncRNA靶基因主要參與嗅覺(jué)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞因子受體相互作用和神經(jīng)活性配體受體相互作用等20條顯著富集通路(圖4B)。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平

對(duì)隨機(jī)選擇的7個(gè)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證，lncRNA表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果一致(圖5)。

2.6 LncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)預(yù)測(cè)7個(gè)lncRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，鑒定了lncRNA的假結(jié)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺藍(lán)色(0)至紅色(1)表示堿基配對(duì)概率(圖6)。

3 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，lncRNA在病毒與宿主相互作用中起著重要的作用。多種病毒感染宿主細(xì)胞后，可以引起宿主lncRNA的差異表達(dá)是一種普遍現(xiàn)象[10-11]。因此，研究lncRNA在病毒感染與復(fù)制中的作用機(jī)制，對(duì)病毒性疾病的診斷預(yù)防及治療具有重要意義。對(duì)于同屬且引起HFMD的重要病原體中， 在腸道病毒71(entero virus 71，EV71)感染RD細(xì)胞和小鼠骨骼肌中分別發(fā)現(xiàn)了23個(gè)和104個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。進(jìn)一步對(duì)差異lncRNA進(jìn)行生物學(xué)功能和通路富集顯示，lncRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，與蛋白質(zhì)結(jié)合，生物代謝等途徑參與EV71感染過(guò)程[12]。此外，有研究將柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16，CVA16)感染RD細(xì)胞后鑒定出60個(gè)上調(diào)表達(dá)和1 210個(gè)下調(diào)表達(dá)的lncRNA。通過(guò)預(yù)測(cè)差異lncRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、修飾作用和順?lè)词焦δ艿?，初步闡明了病毒致病機(jī)制[13]。然而，關(guān)于CVB5感染后差異lncRNA表達(dá)情況及如何調(diào)控病毒與宿主相互作用尚未可知，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 LncRNA與mRNA特征比較Fig 3 Comparison of lncRNA and mRNA characteristics

圖4 GO和KEGG分析差異表達(dá)lncRNA高度富集基因的相關(guān)生物學(xué)途徑Fig 4 Analyzing biological pathway that differentially expressed lncRNA highly enriched genes by GO and KEGG

A.validation results of qPCR; B.primary results of RNA-seq圖5 RT-qPCR驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果Fig 5 Comparisons of RT-qPCR with RNA-seq results

圖6 利用RNAfold軟件對(duì)lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig 6 Secondary structures prediction of lncRNAs were performed using RNAfold software

本研究首先成功構(gòu)建了CVB5感染RD細(xì)胞的模型，隨后通過(guò)RNA-seq分析，獲得了1 268個(gè)差異表達(dá)lncRNA，且在多種生物學(xué)過(guò)程被富集，包括分子結(jié)構(gòu)活性、蛋白質(zhì)分子結(jié)合和體液免疫反應(yīng)等生物過(guò)程，其主要參與嗅覺(jué)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞因子受體相互作用和神經(jīng)活性配體受體相互作用通路等過(guò)程。由于lncRNA具有較長(zhǎng)的核苷酸序列，其復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)與蛋白或核酸相互作用發(fā)揮多種功能，如在MALAT1中，高度保守的富含尿嘧啶的區(qū)域通過(guò)形成三重螺旋而有助于RNA穩(wěn)定[14]；LncRNA MEG3由于兩個(gè)次級(jí)折疊基序的存在從而可發(fā)揮抑制腫瘤的功能[15]。因此，lncRNA的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能具有重要關(guān)系。本研究挑選了經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證正確的7個(gè)lncRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明lncRNA具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能通過(guò)與蛋白質(zhì)、DNA或RNA相互作用發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，但其編碼能力有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

CVB5感染后可導(dǎo)致HFMD及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損失，嚴(yán)重者甚至死亡。然而關(guān)于CVB5感染復(fù)制的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在探索CVB5感染RD細(xì)胞后差異表達(dá)lncRNA表達(dá)譜變化以及對(duì)差異顯著lncRNA的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)，從而為后續(xù)研究lncRNA如何調(diào)控病毒與宿主之間的相互作用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為CVB5感染引起疾病的防治提供一種新思路。