謝 雅，陳 穎，夏德堯，唐鮮娥，王鳳杰，3，陳顯兵*

(1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院 病理科, 湖北 恩施 445000; 湖北民族大學(xué) 2.醫(yī)學(xué)部; 3.科技學(xué)院, 湖北 恩施 445000)

肝損傷是各種因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷，從而影響肝臟的正常功能。近年來肝損傷已成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的疾病之一，目前針對中藥治療肝損傷的研究越來越受到重視。筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHook. f.BIH)，別名紅菌、葛菌，是蛇菰科(Balanophoraceae)蛇菰屬植物，是土家族“四大名藥”之一，含有多糖和黃酮類等成分，具有清除自由基、降血壓、抗腫瘤、止血和降血脂的作用，能提高人體免疫功能[1-3]，但蛇菰多糖(Balanophorapolysaccharide, BPS)對實驗性肝損傷的研究鮮有報道。本研究采用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立藥物性肝損傷模型[4]，通過檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tryrosine kinase receptor B,TrkB)和凋亡相關(guān)蛋白及肝功能的變化，探討對D-gal致大鼠肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為蛇菰多糖(BPS)的藥理作用和臨床運用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：半乳糖(D-galactose，D-gal)(Sigma-Aldrich 公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismu-tase,SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor，TrkB)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白 2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)、半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)抗體(Abcam 公司)。蛇菰多糖(BPS)為本實驗室自制筒鞘蛇菰的多糖提取物。該筒鞘蛇菰全株于2018年夏季采自湖北省恩施市望城坡，經(jīng)湖北民族大學(xué)藥用植物分類與鑒定實驗室鑒定為蛇菰科蛇菰屬植物。筒鞘蛇菰經(jīng)搗碎、水浸、加熱提取、過濾、醇沉、烘干等步驟得蛇菰粗多糖；再經(jīng)Sevage法脫蛋白、水溶、氯仿-正丁醇分離上清、透析、凍干等步驟得BPS(相對分子質(zhì)量為1 ku；級別為RC膜S/P6)。苯酚-硫酸法測定BPS多糖含量為61.3%。

1.1.2 大鼠：SPF級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(220±20)g，湖北省動物實驗中心[許可證號SCXK (鄂) 2015-0018]。

1.2 方法

1.2.1 動物模型與分組：將大鼠隨機(jī)分為對照組(control)；D-gal組(model，皮下注射D-半乳糖200 mg/kg，等劑量蒸餾水灌胃)；BPS低(D-gal+BPS-L)、中(D-gal+BPS-M)、高(D-gal+BPS-H)劑量組(50、100和200 mg/kg BPS灌胃干預(yù))。實驗動物正常進(jìn)食和飲水，分籠伺養(yǎng)，自然光照周期，維持室溫24 ℃，濕度56%左右，共6周。實驗動物操作均符合動物倫理委員會制定的實驗動物操作標(biāo)準(zhǔn)，接受湖北民族大學(xué)動物倫理委員會的監(jiān)督與檢查。

1.2.2 肝功能檢測：大鼠禁食12 h，腹腔注射10%的水合氯醛，取心臟血液，靜置2 h后離心取上清，采用全自動生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測。

1.2.3 檢測SOD活性和MDA含量：取肝組織約5 g，勻漿，離心后取上清液。取血清。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肝臟HE染色：選取大鼠同一部位的肝組織，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片(片厚4 μm)，蘇木素伊紅染色，鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化檢測BDNF、TrkB：取肝組織石蠟切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用雙氧水、血清封閉抗原，加入BDNF、TrkB一抗，濃度1∶500，4 ℃冰箱過夜，加入二抗，DAB顯色，鏡下觀察。

1.2.6 Western blot檢測BDNF、TrkB、Bcl-2、caspase-3和Bax蛋白：6周后，取肝臟組織加入裂解劑及蛋白磷酸酶抑制劑，冰上勻漿，離心，抽取上清，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，加Bcl-2、caspase-3、Bax、BDNF、TrkB一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次3 min，加二抗，室溫孵育2 h后TBST洗膜，ECL發(fā)光檢測，LAS4000mini凝膠成象系統(tǒng)顯影并分析，β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

與對照組相比，D-gal組大鼠活動明顯減少，毛發(fā)粗糙不順，甚至有脫毛現(xiàn)象，進(jìn)食減少。BPS干預(yù)后，上述狀態(tài)均有明顯改善，體質(zhì)量也相對增加。

2.2 BPS對肝損傷大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的影響

與對照組相比，D-gal組ALT和AST水平升高(P<0.05)；與D-gal組相比，BPS各劑量組ALT、AST水平回降(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清中ALT和AST水平

2.3 BPS對肝損傷大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

D-gal組大鼠的肝臟顏色變黃，體積增大，BPS不同劑量組的大鼠肝臟較D-gal組均有所改善。顯微鏡下，D-gal組肝細(xì)胞脂肪變性，少許淋巴細(xì)胞浸潤。BPS低、中、高劑量組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整；中、高劑量組細(xì)胞水腫比低劑量組明顯減輕(圖1)。

2.4 BPS對大鼠肝組織中BDNF、TrkB定位表達(dá)的影響

D-gal組大鼠肝組織中BDNF、TrkB呈黃色或棕黃色顆粒，分布在胞漿內(nèi)。與D-gal組相比，BPS各劑量組大鼠肝組織中BDNF和TrkB陽性表達(dá)強(qiáng)度降低，呈淡黃色細(xì)顆粒狀(圖2)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖1 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果Fig 1 Changes of liver tissues in each group by HE staining (×200)

2.5 BPS對大鼠血清中SOD和MDA水平的影響

與對照組相比，D-gal組SOD 活性降低(P<0.05)、MDA含量增加(P<0.05)；與D-gal相比，BPS各劑量組SOD 活性增加、MDA含量降低(P<0.05)(圖3)。

2.6 BPS對大鼠肝組織中Bcl-2、caspase-3和Bax表達(dá)的影響

與對照組相比，D-gal組大鼠肝組織中Bcl-2表達(dá)量顯著下降，Bax、caspase-3的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，與D-gal組相比，BPS低、中、高劑量組Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)明顯改善(P<0.05)(圖4)。

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖2 BDNF在各組大鼠肝組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of BDNF in liver tissue of rats in each group(×200)

A.control;B.D-gal;C.D-gal+BPS 50 mg/kg;D.D-gal+BPS 100 mg/kg;E.D-gal+BPS 200 mg/kg圖3 TrkB在各組大鼠肝組織中的表達(dá)Fig 3 Expression of TrkB in liver tissue of rats in each group(×200)

2.7 BPS對大鼠肝組織中 BDNF和TrkB的影響

Western blot結(jié)果顯示BDNF、TrkB在正常對照肝組織中表達(dá)較弱；D-gal組肝組織中BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；BPS低、中、高劑量組BDNF、TrkB的表達(dá)與D-gal組相比明顯降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

D-半乳糖作為磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑可引起肝損傷，被廣泛應(yīng)用于肝損傷模型的制備[5]。D-gal通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的合成導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死和炎性細(xì)胞浸潤[6]。ALT、AST是檢測肝功能的重要指標(biāo)，ALT、 AST的升高情況可反應(yīng)肝細(xì)胞的損傷程度[7]。本研究結(jié)果顯示，D-gal組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)水平明顯升高；蛇菰多糖干預(yù)后大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)水平明顯降低，提示蛇多糖能明顯改善D-gal引起的肝損傷。

表1 大鼠血清中SOD和MDA的水平Table 1 SOD and MDA levels in rat

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

A.representative results of Western blot; B.statistical analysis of protein expression level;#P<0.05 compared with control;*P<0.05 compared with D-gal group

SOD是抑制自由基形成的主要抗氧化酶， MDA組大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)水平明顯升高；蛇菰多糖干預(yù)后大鼠體內(nèi)ALT、AST表達(dá)水平明顯降低，提示蛇菰多糖能明顯改善D-gal引起的肝損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，SOD活性降低，MDA水平升高會導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡[8-9]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，Bcl-2為凋亡抑制蛋白。Bcl-2水平升高可抑制Bax的作用，阻斷細(xì)胞色素c釋放，從而抑制caspase-3的活性，抑制細(xì)胞凋亡[10]。本實究結(jié)果表明，D-gal組中SOD活性明顯降低，MDA的含量明顯增加，BPS干預(yù)后SOD活性增加，MDA的含量降低，同時Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)發(fā)生了相應(yīng)的改變。提示BPS具有提高機(jī)體抗氧化能力和抑制肝細(xì)胞凋亡的作用。

BDNF是重要的營養(yǎng)因子，可特異性結(jié)合其受體TrkB，使其磷酸化并激活細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶信號通路[11]，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF和TrkB不僅存在于海馬等組織中，還存在于多種受損的組織中，肝組織中BDNF表達(dá)的增加可能導(dǎo)致肝病的高發(fā)病率[12]。本研究中，BDNF和TrkB在正常肝組織中無表達(dá)，D-gal損傷后表達(dá)明顯增加，BPS干預(yù)后表達(dá)降低，提示BPS對肝臟的保護(hù)作用與BDNF、TrkB的表達(dá)降低有一定聯(lián)系。

綜上所述，BPS可以提高D-gal誘導(dǎo)的肝損傷后細(xì)胞的肝臟的抗氧化能力，表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性升高，MDA含量降低；同時可提高肝組織中Bcl-2的表達(dá)、從而抑制Bax和caspase-3的表達(dá)水平，達(dá)到抑制肝細(xì)胞凋亡的作用；BPS還可改善D-gal誘導(dǎo)的肝損傷后細(xì)胞中BDNF和TrkB的表達(dá)，從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。BPS是筒鞘蛇菰(BIH)的提取物，其護(hù)肝作用機(jī)制尚不清楚，因此深入研究其作用機(jī)制對開發(fā)中藥治療肝損傷具有重要的理論意義和實用價值。