史鐵偉， 李天柱， 周 靜， 娜日蘇，孫 琪，許麗艷，白春英*

(1.赤峰學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 內(nèi)蒙古人類遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.汕頭大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 潮汕沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤分子生物學(xué)廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515000)

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是人體必需的一種脂肪酸，其代謝產(chǎn)物與多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1-2]，尤其在致癌過程的發(fā)生、發(fā)展及防治靶點(diǎn)中的重要作用引起越來越多科研人員的重視和關(guān)注[3-4]。5-脂氧合酶(5-lipoxygen-ase,5-LO)是花生四烯酸代謝途徑中關(guān)鍵的兩個(gè)限速酶之一，前期工作表明，5-LO的表達(dá)與鱗狀食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期(病理學(xué)上的TNM分期)顯著相關(guān)，5-LO表達(dá)的上調(diào)與疾病的晚期和食管癌(esoplageal sequamous cell carcinoma,ESCC)預(yù)后不良有關(guān)[5]。在5-LO代謝通路上，需要5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase activating protein,FLAP)傳遞花生四烯酸并激活5-LO，隨后引起的一系列生理變化，包括炎性細(xì)胞趨化因子白三烯B4的合成，可見FLAP在該代謝通路的重要性。

MK886作為FLAP的抑制劑，通過上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)肝母細(xì)胞瘤[6]和卵巢癌[7]均有一定的抗腫瘤作用。雖然前期研究發(fā)現(xiàn)5-LO和食管癌的發(fā)生及惡化關(guān)系密切，成正相關(guān)。然而FLAP在食管癌中的作用分子機(jī)制尚不清楚，MK886在食管癌中對(duì)于抗腫瘤效果如何仍然不明確。本研究探討MK886對(duì)人食管癌細(xì)胞系KYSE-150和TE-3的細(xì)胞功能影響，以及可能的作用機(jī)制。為臨床食管癌的發(fā)病機(jī)制和腫瘤藥物使用提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細(xì)胞系KYSE-150和TE-3(中科院上海細(xì)胞庫)；RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Hyclone公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人caspase-3、cleaved-caspase-9、LC3A/B、PARP等抗體(CST公司)；鼠抗人β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗(Santa Cruz公司)；ECL試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白質(zhì)濃度測(cè)量、蛋白質(zhì)印跡有關(guān)試劑(Bio-Rad公司)；青霉素-鏈霉素溶液(100×)以及蛋白質(zhì)提取相關(guān)試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PI/RNase Staining Buffer(BD公司)；MK886(Tocris Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將人食管癌細(xì)胞系KYSE-150和TE-3均分別用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞匯合率為70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)和培養(yǎng)液顏色換液傳代。此2種細(xì)胞均貼壁增殖，后續(xù)實(shí)驗(yàn)如無特殊說明均使用對(duì)數(shù)期細(xì)胞。

1.2.2 RTCA分析儀檢測(cè)細(xì)胞增殖：將MK886抑制劑粉末10 mg用DMSO溶解成100 mmol/L母液備用(-20 ℃不超過1個(gè)月)，使體外實(shí)驗(yàn)DMSO的終體積分?jǐn)?shù)不高于0.05%。應(yīng)用RTCA分析儀(xCELLigence RTCA系統(tǒng))檢測(cè)細(xì)胞增殖，在E-plate每孔放入5 000個(gè)細(xì)胞。程序設(shè)定加藥物前每30 min檢測(cè)1次細(xì)胞增殖情況，加入藥物后每10 min檢測(cè)1次細(xì)胞增殖情況(表1)。

表1 xCELLigence RTCA系統(tǒng)運(yùn)行程序

放置細(xì)胞培養(yǎng)過夜，然后，每孔加入5 μL的MK886藥物使得最終濃度分別為2.5、5、10、20、40和80 μmol/L(藥物母液用無血清培養(yǎng)基稀釋)，跳過程序2，從程序3開始持續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，處理48 h，記錄試驗(yàn)結(jié)果，分析數(shù)據(jù)同時(shí)確定半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentra-tion，IC50)。

1.2.3 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：藥物處理細(xì)胞后，分不同時(shí)間收集，加入PBS，500×g離心5 min，洗滌不同處理后細(xì)胞，棄上清。加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇(-20 ℃保存)中，吹打均勻，4 ℃固定在試管里18 h以上。500×g離心5 min，小心棄上清，將試管小心倒扣在濾紙上，吸盡酒精，彈起細(xì)胞。加入0.5 mL PI/RNase染色液，充分混勻細(xì)胞后，37 ℃孵育15 min。分析前4 ℃避光保存樣本，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀BD-C6檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果分析并繪制圖(繪圖結(jié)果只顯示G0/G1、S和G2/M期，G1CV和G2/M CV不顯示)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中的caspase-3、cleaved-caspase-9、LC-3A/B和PARP蛋白表達(dá)：確定IC50后，分別收集0、12.5、25和50 μmol/L的MK886處理48 h后的食管癌細(xì)胞。以DMSO處理作為對(duì)照組，用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；40 μg上樣量，進(jìn)行10% SDS-PAGE，電泳分離后的蛋白質(zhì)移至PVDF膜上，用含5%的脫脂奶粉封閉液置于室溫封閉2 h，分別加入一抗caspase-3、cleaved-caspase-9、LC-3A/B、PARP(稀釋比例為1︰500)和β-actin(稀釋比例為1︰1 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，10 min/次，加入二抗(稀釋比例為1︰5 000)，37 ℃反應(yīng)1 h；TBST洗膜3次，10 min/次，按照ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影。Alpha成像設(shè)備拍照，分析。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin吸光值的比值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MK886抑制KYSE-150和TE-3細(xì)胞的增殖

與0 μmol/L組比較，不同濃度MK886處理KYSE-150和TE-3細(xì)胞48 h后，隨著MK886濃度增加，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制(圖1)。

2.2 MK886對(duì)食管癌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的影響

xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)計(jì)算MK886處理KYSE-150和 TE-3的IC50值為29.11和27.47 μmol/L。KYSE-150和TE-3的藥物處理濃度設(shè)置為12.5、25和50 μmol/L 3種濃度，處理時(shí)間為48 h(圖2)。

*P<0.05, **P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖1 MK886對(duì)KYSE-150和TE-3細(xì)胞增殖的影響Fig 1 Effects of MK886 on proliferation ability of KYSE-150 and TE-3

圖2 xCELLigence RTCA系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)MK886對(duì)KYSE-150和TE-3細(xì)胞藥物毒性試驗(yàn)計(jì)算IC50

2.3 檢測(cè)MK886對(duì)食管癌細(xì)胞周期的影響

與0 μmol/L組比較，食管癌細(xì)胞系KYSE-150和TE-3細(xì)胞隨著MK886處理濃度的增加，出現(xiàn)了G0/G1期滯后增加明顯(P<0.001)；MK886處理濃度增加到50 μmol/L，G2/M期增加明顯(P<0.001和P<0.01)(圖3)。

2.4 MK886對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡和自噬蛋白表達(dá)的影響

與0 μmol/L組比較，食管癌細(xì)胞系KYSE-150和TE-3細(xì)胞隨著MK886處理濃度的增加，cleaved-caspase-3和LC-3A/B-Ⅱ蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.001)(圖4)。

3 討論

除了參與炎性反應(yīng)的發(fā)生以外，越來越多證據(jù)表明5-LO代謝通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[8-9]。5-LO除了參與白三烯經(jīng)典功能外，在促炎性消退脂類介質(zhì)(specialized pro-resolvinglipid mediators，SPM)的生物合成中的重要作用越發(fā)引起人們重視[10-11]，尤其腫瘤炎性微環(huán)境中SPM可以減少促炎、促腫瘤介質(zhì)的產(chǎn)生，包括調(diào)動(dòng)人體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展。由于FLAP在5-LO代謝通路起關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白作用，MK886作為FLAP的抑制劑，可以阻斷白三烯的產(chǎn)生，提示人們FLAP抑制劑作為癌的化學(xué)預(yù)防劑有巨大潛力[12]。

自噬(autophagy)是一種真核細(xì)胞的生存機(jī)制，尤其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，細(xì)胞自噬的作用顯示了兩面性和機(jī)制復(fù)雜性[13]。本研究利用MK886處理人食管癌細(xì)胞系KYSE150和TE3，采用xCELLigence RTCA系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)MK886明顯抑制食管癌細(xì)胞系的增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物處理濃度增加至25 μmol/L，食管癌細(xì)胞G0/G1期滯后增加明顯，MK886處理濃度增加到50 μmol/L，食管癌細(xì)胞G2/M期增加明顯，提示不同濃度MK886處理食管癌細(xì)胞系影響其細(xì)胞周期的變化機(jī)制不完全一致，需要進(jìn)一步研究。蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MK886處理后食管癌細(xì)胞系隨著濃度增加， caspase-3和LC-3A/B-Ⅱ蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說明不同濃度的MK886對(duì)食管癌細(xì)胞通過caspase-3途徑發(fā)揮凋亡機(jī)制，高濃度的MK886會(huì)引起食管癌細(xì)胞系發(fā)生自噬消除藥物影響。

*P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖3 不同濃度MK886對(duì)食管癌細(xì)胞系周期的影響

*P<0.05, **P<0.001 compared with 0 μmol/L group圖4 不同濃度MK886對(duì)食管癌細(xì)胞系凋亡和自噬蛋白表達(dá)的影響

綜上所述， MK886可以抑制食管癌細(xì)胞系的增殖，引起細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能涉及不同細(xì)胞周期通路變化和caspase-3凋亡途徑。高濃度處理后細(xì)胞表現(xiàn)的自噬現(xiàn)象提示須注意臨床用藥的劑量控制，防治細(xì)胞自噬發(fā)生從而產(chǎn)生耐藥性。MK886作為食管癌的化學(xué)預(yù)防劑潛力較大，F(xiàn)LAP有望成為食管癌預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)。